实验概要本实验利用酮体测定法对脂肪酸的β-氧化进行了测定，介绍了该方法的原理及步骤等。实验原理酮体包括乙酰乙酸、b—羟丁酸和丙酮三种物质。在肝脏中，脂肪酸经b—氧化作用生成乙酰CoA。生成的乙酰CoA可经代谢缩合成乙酰乙酸，而乙酰乙酸既可脱羧生成丙酮，又可经b—羟丁酸脱氢酶作用被还原生成b—羟丁酸，三种物质统称酮体。酮体为机体代谢的正常中间产物，在肝脏中生成后须被运往肝外组织才能被机体所利用。在正常情况下，动物体内含量甚微；患糖尿或食用高脂肪膳食时，血中酮体含量，尿中也能出现酮体。本实验用丁酸做底物，将之与新鲜的肝匀浆一起保温后，再测定其中酮体的生成量。因为在碱性溶液中碘可以将丙酮氧化为碘仿（CHI3），所以通过用硫代硫酸钠（Na2S2O3）滴定反应中剩余的碘就可以计算出所消耗的碘量，进而可以求出以丙酮为代表的酮体含量。有关的反应式如下： 根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫酸钠溶液体积之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。主要试剂1. 10%（w/v）氢氧化钠溶液：称取10g氢氧化钠，在烧杯中用少量蒸馏水将之溶解后，定容至100ml。2. 0.1mol/L正丁酸溶液：称取13g碘和约40g碘化钾，放置于研钵中。加入少量蒸馏水后，将之研磨至溶解。用蒸馏水定容到1000ml，在棕色瓶中保存。此时可用标准硫代硫酸钠溶液标定其浓度。3. 0.5mol/L正丁酸：取0.05ml正丁酸，用0.5mol/L氢氧化钠溶液100ml溶解即成。4. 0.1mol/L碘酸钾（KIO3）溶液：称取0.8918g干燥的碘酸钾，用少量蒸馏水将之溶解，Z后定容至250ml5. 0.1mol/L硫代硫酸钠（Na2S2O3）溶液：称取25g硫代硫酸钠，将它溶解于适量煮沸的蒸馏水中，并继续煮沸5min。冷却后，用冷却的已煮沸过的蒸馏水定容到1000ml。此时即可用0.1mol/L碘酸钾溶液标定其浓度。6. 硫代硫酸钠溶液的标定：将蒸馏水25ml、碘化钾2g、碳酸氢钠0.5g、10%盐酸溶液20ml加入一支锥形瓶内。另取0.1mol/L碘酸钾溶液25ml加入其中，然后用硫代硫酸钠溶液将之滴定至浅黄色。再加入0.1%淀粉溶液2ml，然后继续用硫代硫酸钠溶液将之滴定至蓝色消褪为止。另设一空白，其中仅以蒸馏水代替碘酸钾，其余操作相同。计算硫代硫酸钠溶液的浓度所依据的反应式如下：5KI KIO3 6HCI=3I2 6KCI 3H2OI2 2Na2S2O3=Na2S4O6 2NaI7. 10%(v/v)盐酸溶液：取10ml盐酸，用蒸馏水稀释到100ml。8. 0.1%(w/v)淀粉溶液：称取0.1g可溶性淀粉，置于研钵中。加入少量预冷的蒸馏水，将淀粉调成糊状。再慢慢倒入煮沸的蒸馏水90ml，搅匀后，再用蒸馏水定容至100ml。9. 0.9%(w/v)氯化钠。10. 1/15mol/L、PH7.7磷酸缓冲液（A液）1/15mol/L Na2HPO4溶液：称取Na2HPO4·2H2O1.187g，将之溶解于100ml蒸馏水中即成。（B液）1/15mol/L KH2PO4溶液：称取KH2PO40.9078g，将之溶解于100ml蒸馏水将之溶解，Z后定容至100ml。取A液90 ml、B液10 B液，将两者混合即可。主要设备1. 匀浆器（或搅拌机）2. 碘量瓶。实验材料动物活体实验步骤1．肝匀浆的制备 1) 将动物（如鸡、家兔、大鼠或豚鼠等）放血处死，取出肝脏。 2) 用0.9%氯化钠溶液洗去肝脏上的污血，然后用滤纸吸去表面的水分。溶液至总体积为10ml。2．酮体生成 1) 取两个锥形瓶，编号，按下表操作。锥形瓶试剂（ml）AB新鲜肝匀浆—2.0预先煮沸的肝匀浆2.0—PH7.7 的磷酸缓冲液3.03.00.5mol/L正丁酸溶液2.02.0 2) 将加好试剂的2个锥形瓶摇匀，放入43℃恒温水浴锅中保温40min后取出。 3) 于2个锥形瓶分别加入20%三溶液[注2]3ml，摇匀后，于室温放置10min。 4) 将锥形瓶中的混合物分别用滤纸在漏斗上过滤，收集无蛋白滤液于事先编号A、B的试管中。3．酮体的测定 1) 取碘量瓶[注3]2个，根据上述编号顺序按下表操作。碘量瓶编号试剂（ml）AB无蛋白滤液5.05.00.1mol/L碘液3.03.010%NaOH3.03.0 2) 加完试剂后摇匀，将碘量瓶于室温放置10min。 3) 于各碘量瓶分别滴加10%盐酸溶液，使各瓶中溶液中和到中性或微酸性（可用PH试纸进行检测）。 4) 用0.02mol/L硫代硫酸钠溶液滴定到碘量瓶中的溶液呈浅黄色时，往瓶中滴加数滴0.1%淀粉溶液，使瓶中溶液呈蓝色。 5) 继续用0.02mol/L硫代硫酸钠溶液滴定到碘量瓶中溶液的蓝色消褪为止。 6) 记录下滴定时所用去的硫代硫酸钠溶液毫升数，按下式计算样品中丙酮的生成量。4．结果与计算根据滴定样品与对照所消耗的硫代硫钠溶液体积之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。实验中所用肝匀浆中生成丙酮的量（mol）=（A－B）×C×1/6A：为滴定样品A（对照）所消耗的0.02mol/L硫代硫酸钠溶液的毫升数。B：不滴定样品B所消耗的0.02mol/L硫代硫酸钠溶液的毫升数。C：硫代硫酸钠溶液的浓度（mol/L）注意事项1. 肝匀浆必须新鲜，放置久则失去氧化脂肪酸能力。2. 三作用是使肝匀浆的蛋白质、酶变性，发生沉淀。3. 碘量瓶作用是防止碘液挥发，不能用锥形瓶代替。
评论
沪江诗雨 
长按识别二维码查看信息详情