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- af05522 2016-08-20 00:00:00
- 可用于基因工程中目的基因的获取,扩增目的基因
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- 小啦啦gg 2016-08-20 00:00:00
- PCR技术能快速特异地在体外复制目的,理论上能将其量极微的(fg DNA)目的基因在较短的时间内(1-2小时)扩增到极易检测的微克水平。PCR技术目前已经成为人们获得目标基因的Z常用的方法之一。然而其基本原理并不复杂,主要包括模板DNA(目标DNA)加热变性;降温后反应混合物中特异性引物与单链DNA模板的复性;72℃条件下,Taq酶诱导引物借助模板信息由5’端到3’端延伸。每一轮反应,模板拷贝数都增加一倍,理论上n次循环后,扩增产物拷贝数为2n-1。但在PCR反应后期由于底物的消耗,Taq酶活力的下降,PCRYZ物的增加,PCR反应的指数形式逐渐转化为线性形式进入扩增的平台期,实际上30-35个循环,扩增倍数一般可达百万倍。如果想再提高扩增产物的量,可以将产物DNA再稀释1000倍作为新的模板进行第二轮的pcr扩增,一般二次扩增后的DNA数量已达到所有分子生物学操作的要求。 一、 变性,DNA双螺旋结构的生物功能在于复制与转录,加热或在碱性条件下可以使DNA双螺旋的氢键断裂,形成单链DNA,称之为DNA变性。解除条件后,变形的单链DNA可以重新结合起来,再形成双链,称之为DNA复性,又叫退火。DNA双链离解一半时温度称为解链温度(Tm)。不同DNA的解链温度不同,取决于DNA中G-C与A-T的含量的区别。G-C间有三个氢键,A-T间有两个氢键,因此G-C比例大的DNA片段解链温度高,一般,G-C含量每增加1%,PCR变性温度增加0.4℃。Tm范围通常一般在85-95℃之间,PCR变性温度选择94℃,变性时间为30秒到2分钟。
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1、什么是PCR
PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称,其是一种用于放大扩增特定的DNA(或RNA)片段的分子生物学技术。这种技术模拟体内DNA的天然复制过程,能将微量的DNA进行特异性的扩增,在短时间内获得足够的DNA,是分子生物学研究中不可缺少的一员。
2、标准PCR的过程
此项技术是模拟DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物,在整个PCR过程中包含了变性——退火(复性)——延伸三个基本反应步骤。
DNA变性(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA。
退火(复性)(40℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。
延伸(68℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右最佳的活性)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′ 端延伸,合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍。
3、为什么要使用梯度PCR仪呢
梯度PCR仪是指一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件的仪器,因为不同的DNA片段其最适退火温度不同,采用梯度PCR仪通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增,从而一次性PCR扩增就可以筛选出表达量高的最适退火温度,优化反应条件,进行有效的扩增。
在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合。
使用普通的PCR仪进行扩增时,只能运行一个特定的退火温度,当目的基因的退火温度不适时,就可能出现假阳性,影响实验结果。而对于梯度PCR仪,不但可以作为普通PCR仪使用,也可以通过设置不同的温度梯度(通常为12个梯度温度),研究未知DNA退火温度的扩增,有效降低或避免假阳性,同时在不理想的工作条件下扩增出产物,既节约成本也提高了实验效率。
适用于分子生物学、微生物学、遗传学、细胞生物学、食品科学和农学等领域,进行分子克隆、基因表达分析、基因型鉴定、测序、病原微生物分析等实验研究。
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