pfu dna polymerase是目前已知dna合成准确性Z高的酶。在正常的pcr扩增程序下,其扩增产物的错误率为4000bp中发生一个。错误率仅为taq dna polymerase的1∕7--1∕10。pfu dna polymerase的耐高温性亦优于taq dna polymerase,变性温度可高至98℃(此时必须加矿物油以免反应组分蒸发)以扩增gc含量较高的模板。
通常pfu dna polymerase的扩增程序为:
变性温度 94℃-98℃, 5-10分钟
变性温度 94℃-98℃, 15秒-2分钟
复性温度 40℃-68℃, 30秒-2分钟
延伸温度 68℃-75℃, 扩增速率1分钟1kb,根据目的片断长度另加15秒至1 分30秒, pfu dna polymerase的Z适温度在74℃左右。
扩增25到35个循环。
注意事项:
1. pfu dna polymerase由于具有校正功能,dna合成速率慢于 taq dna polymerase,同时所需的dntp量一般要高于 taq dna polymerase,一些小公司的dntp浓度往往低于其标定值有时甚至要低一倍左右,导致pfu dna polymerase的扩增失败。
2. pfu dna polymerase产生的片断为平末端,不能直接用于t-载体克隆,可用taq dna polymerase加a末端后再用于t-载体克隆或直接在引物的5’端设计合适的酶切位点,酶切后再克隆到相应酶切载体。
3. 保存在-20℃。 本产品pfu dna polymerase 的storage buffer组分为:50mm tris-hcl(ph8.2 at 25℃),0.1mm edta, 1mm dtt,50%甘油,0.05% chaps;
10x reaction buffer with mgso4的组分为: 200mm tris-hcl(ph8.8 at 25℃),100mm kcl,100mm (nh4)2so4, 20mm mgso4, 1.0% triton x-100, 1mg/ml bsa。