为什么pcr扩增得到的目的基因不能直接用于连接反应

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR是一种体外DNA扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。PCR扩增仪在环境检测中，靶核酸序列往往存在于—个复杂的混合物如细胞提取液中，且含量很低，对于探测这种复杂群体中的特异微生物或某个基因，杂交就显得不敏感。使用PCR技术可将靶序列放大几个数量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生物群体结构。PCR技术常与其他技术结合起来使用，如RT-PCR、竞争PCR、巢式PCR、RAPf)、ARDRA等。类别听语音竞争性PCR是一种定量PCR，通过向PCR反应体系中加入人工构建的带有突变的竞争模板、控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度，对目的模板作定量研究。将PCR技术和限制酶切技术结合使用，用限制酶酶切目的基因的PCR扩增产物，通过对酶切产物的分析，探测该基因的多态性。RAPD(randomlyamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)也是应用比较广泛的一项技术。RAPD是用那些对某—特定基因的非特异性的引物来扩增某些片段。RAPD分析用于探测含有混合微生物种群的各种生物反应器中的微生物多样性。用RAPD分析所得到的基因组指纹图谱在比较一段时间内微生物种群的变化以及比较小试规模和中试规模的反应器方面是有用的，但还不足以用来估测群落的生物多样性。步骤听语音PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。