GX液相是什么原理？

GX液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。GX液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。
GX液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
1．液固色谱法 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。
2．液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。
涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。
正相色谱法：采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。
反相色谱法：一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用Z为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右的时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用Z为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。

（一）GX液相色谱分析的流程
　　由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，
而ＨＰＬＣ改变的是流动相极性，使样品各组分在Z佳条件下得以分离。

GX液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（Z高输送压力可达4.9??107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。
特点

1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。
2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。GX液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于 1h 。
3. GX：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。
4.高灵敏度：GX液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。
5.适应范围宽：气相色谱法与GX液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而GX液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于 400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的 75% ～ 80% ）原则上都可应用GX液相色谱法来进行分离、分析。 据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。

GX液相色谱按其固定相的性质可分为GX凝胶色谱、疏水性GX液相色谱、反相GX液相色谱、GX离子交换液相色谱、GX亲和液相色谱以及GX聚焦液相色谱等类型。用不同类型的GX液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是GX液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，

GX液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、．分离系统、检测系统和数据处理系统，下面将分别叙述其各自的组成与特点。

1．进样系统

一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作，进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。

2．输液系统

该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l．47～4．4X107Pa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存错和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值，或改用竞争性YZ剂或变性剂等。这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。

3.分离系统

该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10～50cm（需要两根连用时，可在二者之间加一连接管），内径为2～5mm，由"优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，住内装有直径为5～10μm粒度的固定相（由基质和固定液构成）．固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成，它们都有惰性（如硅胶表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔径可达1000?）和比表面积大的特点，加之其表面经过机械涂渍（与气相色谱中固定相的制备一样），或者用化学法偶联各种基因（如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物。因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。

另外，固定相基质粒小，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。基质粒度小，微孔浅，样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论分析，基质粒度小，塔板理论数N就越大。这也进一步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。

再者，GX液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C，通过改善传质速度，缩短分析时间，就可增加层析柱的效率。

4．检测系统

GX液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。

（1）紫外检测器

该检测器适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测。其特点：使用面广（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；灵敏度高（检测下限为10-10g／ml）；线性范围宽；对温度和流速变化不敏感；可检测梯度溶液洗脱的样品。

（2）示差折光检测器

凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。目前，糖类化合物的检测大多使用此检测系统。这一系统通用性强、操作简单，但灵敏度低（检测下限为10-7g／ml），流动相的变化会引起折光率的变化，因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测。

（3）荧光检测器

凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此，这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定，其灵敏度很高（检测下限为10-12～10-14g／ml），痕量分析和梯度洗脱作品的检测均可采用。

（5）数据处理系统

该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。

GX液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。

1．液固色谱法　使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。

2．液液色谱法　使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。

涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。

液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。

正相色谱法　采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。

反相色谱法　一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用Z为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。

随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。

正相色谱法与反相色谱法比较表

正相色谱法
反相色谱法

固定相极性
高～中
中～低

流动相极性
低～中
中～高

组分洗脱次序
极性小先洗出
极性大先洗出

从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。

3．离子交换色谱法　固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。

缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。

4．离子对色谱法　又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。

分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。

分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。

离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。
5．排阻色谱法　固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。

HPLC是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

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GX液相色谱法的分类及其分离原理

GX液相色谱法分为：液
-
固色谱法、液
-
液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法。

1.
液
-
固色谱法（液
-
固吸附色谱法）

固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。

①液
-
固色谱法的作用机制

吸附剂：一些多孔的固体颗粒物质，其表面常存在分散的吸附ZX点。

流动相中的溶质分子
X
（液相）被流动相
S
带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，
发生如下交换反应：

X
（液相）
+nS
（吸附）
<==>X
（吸附）
+nS
（液相）

其作用机制是溶质分子
X
（液相）
和溶剂分子
S
（液相）
对吸附剂活性表面的竞争吸附。

吸附反应的平衡常数
K
为：

K
值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附的溶质分子很少，先流出色谱柱。

K
值较大：表示该组分分子的吸附能力较强，后流出色谱柱。

发生在吸附剂表面上的吸附
-
解吸平衡，就是液
-
固色谱分离的基础。

②液
-
固色谱法的吸附剂和流动相

常用的液
-
固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化
铝、分子筛、聚酰胺等。

一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间的作用
力很弱，分配比
k
较小，
保留时间较短；
但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，
分配
比
k
大，保留时间长。

对流动相的基本要求：

试样要能够溶于流动相中

流动相粘度较小

流动相不能影响试样的检测

常用的流动相：甲醇、、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。

③液
-
固色谱法的应用

常用于分离极性不同的化合物、
含有不同类型或不；
数量官能团的有机化合物，
以及有
机化合物的不同的异构体；但液
-
固色谱法不宜用于分离同系物，因为液
-
固色谱对不同相对
分子质量的同系物选择性不高。

2.
液
-
液色谱法（液
-
液分配色谱法）

将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。

①液
-
液色谱法的作用机制

溶质在两相间进行分配时，
在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，
在色谱柱中
向前迁移速度较快；
在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，
在色谱柱中向前迁移速
度较慢，从而达到分离的目的。

液
-
液色谱法与液
-
液萃取法的基本原理相同，均服从分配定律：
K=C
固
/C
液

K
值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。

②正相色谱和反相色谱

正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相。

反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相。

一般地，正相色谱是固定液的极性大于流动相的极性，而反相色谱是固定相的极性小
于流动相的极性。
正相色谱适宜于分离极性化合物，
反相色谱则适宜于分离非极性或弱极性
化合物。

③液
-
液色谱法的固定相

常用的固定液为有机液体，
如极性的
β
，
β′
氧二丙（
ODPN
）
，
非极性的十八烷
（
ODS
）
和异二十烷（
SQ
）等。
缺点：涂渍固定液容易被流动相冲掉。
采用化学键合固定相则可以避免上述缺点。
使固定浓与担体之间形成化学键，例如在硅胶表面利用硅烷化反应：形成
Si-O-Si-C
型键，把固定液的分子结合到担体表面上。
优点
化学键合固定相无液坑，液层薄，传质速度快，无固定液的流失。
固定液上可以结合不同的官能团，改善分离效能。
固定液不会溶于流动相，有利于进行梯度洗提。
④液
液色谱法的应用
液
-
液色谱法既能分离极性化合物，又能分离非极性化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、稠
环、染料、
留族等化合物。
化合物中取代基的数目或性质不同，
或化合物的相对分子质量不
同，均可以用液
-
液色谱进行分离。

3.
离子交换色谱法

原理：离子交换色谱法是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷
的被测离子进行可逆交换，
由于被测离子在交换剂上具有不同的亲和力
（作用力）
而被分离。

①离子交换色谱法的作用机制

聚合物的分子骨架上连接着活性基团，如：-SO3-，-N（CH3）3+等。为了保持离子交
换树脂的电中性，活性基团上带有电荷数相同但正、负号相反的离子X，称为反离子。活性
基团上的反离子可以与流动相中具有相同电荷的被测离子发生交换：
离子交换色谱的分配过程是交换与洗脱过程。交换达到平衡时 K值越大，保留时间越长。 ②溶剂和固定相
两种类型：多孔性树脂与薄壳型树脂。
多孔性树脂：极小的球型离子交换树脂，能分离复杂样品，进样量较大；缺点是机械
强度不高，不能耐受压力。
薄壳型离子交换树脂：在玻璃微球上涂以薄层的离子交换树脂，这种树脂柱效高，当
流动相成分发生变化时，不会膨胀或压缩；缺点是但柱子容量小，进样量不宜太多。
③离子交换色谱法的应用
主要用来分离离子或可离解的化合物，凡是在流动相中能够电离的物质都可以用离子
交换色谱法进行分离。
广泛地应用于：
无机离子、
有机化合物和生物物质(如氨基酸、核酸、蛋白质等)的分离。
4.凝肤色谱法（空间排阻色谱法）
凝胶是一种多孔性的高分子聚合体，表面布满孔隙，能被流动相浸润，吸附性很小。
凝胶色谱法的分离机制是根据分子的体积大小和形状不同而达到分离目的。
①凝胶色谱法的作用机制
体积大于凝胶孔隙的分子，由于不能进入孔隙而被排阻，直接从表面流过，先流出色
谱柱；
小分子可以渗入大大小小的凝胶孔隙中而完全不受排阻，
然后又从孔隙中出来随载液
流动，
后流出色谱柱；中等体积的分子可以渗入较大的孔隙中，但受到较小孔隙的排阻，介
乎上述两种情况之间。
凝胶色谱法是一种按分子尺寸大小的顺序进行分离的一种色谱分析方法。
②凝胶色谱法的固定相
软质凝胶、半硬质凝胶和硬质凝胶三种。
③凝胶色谱法的应用特点
保留时间是分子尺寸的函数，适宜于分离相对分子质量大的化合物，相对分子质量在
400～8×105的任何类型的化合物。
保留时间短，色谱峰窄，容易检测。
固定相与溶质分子间的作用力极弱，趁于零，柱的寿命长。
不能分辨分子大小相近的化合物，分子量相差需在10%以上时才能得到分离。