谁能提供一份关于液相色谱培训的小结？

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  南宫三九 2013-08-14 00:00:00

  是需要仪器使用维护方面的培训还是分析方法原理方面的培训？

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  欧阳静射手 2013-08-14 00:00:00

  【摘要】 目的提高雷公藤片的质量标准，摸索GX液相色谱（HPLC）法测定雷公藤片含量的方法。 方法采用GX液相色谱法，C18柱，流动相为甲醇-水（40∶60），检测波长218 nm。结果雷公藤甲素线性范围为0.047 6～0.476 0 μg，r=0.9991，平均回收率为101.2%， RSD为2.1%（n=6）。结论 雷公藤片含量测定限度暂定为：每片含雷公藤以雷公藤甲素（C37H22O14）计，不得少于0.01 mg/片。 【关键词】 雷公藤片 雷公藤甲素 GX液相色谱　　雷公藤片为卫矛科木质藤本植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook.f，药材经醋酸乙酯提取后制成的片剂，原卫生部药品标准采用薄层扫描法［1］测定雷公藤片中雷公藤甲素的含量，因雷公藤药材中成分较为复杂，采用薄层法难以得到较好的分离效果，且其展开显色后极不稳定，显色剂褪色较快，难以得到较好的测定结果。为了有效地控制其质量，国家药品标准行动计划组下达了提高雷公藤片质量标准的任务。通过实验研究，本文建立了HPLC法测定雷公藤片中雷公藤甲素的含量，经研究其中雷公藤甲素在所选用条件下分离较好，检测灵敏度高，测定专属性强，可以作为本品的含量测定控制方法。　　1 仪器与试药 　　HP-1100型GX液相色谱仪（Ajilent公司，美国）；大连依利特Hypersil C18液相色谱柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；雷公藤甲素对照品（ZG药品生物制品检定所，批号0857-9601）；甲醇为色谱纯，水为重蒸水；其他试剂为分析纯；雷公藤片由湖北三九黄石药业有限公司提供。　　2 方法与结果　　2.1 色谱条件 　　色谱柱为大连依利特Hypersil C18液相色谱柱（200 mm×4.6 mm，5μm）；甲醇-水（40∶60）为流动相；检测波长218 nm；流速1 ml/min；柱温：35℃；理论板数按雷公藤甲素峰计不低于3 000。　　2.2 供试液制备方法和洗脱液用量的选择　　2.2.1 供试液制备方法的选择 　　雷公藤制剂中成分较为复杂，不经提取精制难以得到较好的分离效果，参照常雪灵等［2］的文献报道，进行了提取精制方法的考察。精密称取样品粉末约1 g，加醋酸乙酯20 ml，超声使溶解，加5%HCl溶液15 ml洗涤两次，弃去酸液，醋酸乙酯液加10%NaOH溶液20 ml，水浴加热15 min，分取碱液，并用10%NaOH溶液20 ml萃取两次，合并碱液，加稀HCl调pH至4，以醋酸乙酯20 ml萃取3次，合并醋酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，定容至10 ml作为供试品溶液。 精密称取样品粉末约1 g，加氯仿10 ml，超声10 min，加中性氧化铝1 g，搅拌均匀，蒸干，上中性氧化铝柱（内径12 mm，100～200目，10 g），以醋酸乙酯溶液洗脱，收集洗脱液150 ml，蒸干，残渣加甲醇使溶解，定容至10 ml作为供试品溶液。 精密称取样品粉末约1 g，加氯仿10 ml，超声10 min，加中性氧化铝1g，搅拌均匀，蒸干，上中性氧化铝柱（内径12 mm，100～200目，10 g），以10%醋酸乙酯石油醚（60～90℃）50 ml 洗脱，再以1%乙醇醋酸乙酯溶液洗脱，收集洗脱液100 ml，蒸干，残渣加甲醇使溶解，定容至10 ml作为供试品溶液。 取上述3种溶液按拟定的色谱条件分别进样。结果见表1。表1 3种提取分离方法测定结果（略） 结果表明：采用上中性氧化铝柱提取分离效果较萃取法好，方法3中用10%醋酸乙酯石油醚（60～90℃）50 ml 洗脱主要是除去杂质，但经比较此法对分离影响不大，而以1%乙醇醋酸乙酯溶液洗脱对测定结果无多大影响，但洗下较多杂质，基线波动较大，杂质峰较多，对分离造成一定影响，故采用方法2作为含量测定方法。　　2.2.2 溶剂用量的选择精密称取样品粉末约1 g，共3份，分别加氯仿10 ml，超声10 min，加中性氧化铝1 g，搅拌均匀，蒸干，上中性氧化铝柱（内径12 mm，100～200目，10 g），以醋酸乙酯溶液洗脱，分别收集洗脱液100 ，150 ，200 ml，蒸干，残渣加甲醇使溶解，定容至10 ml作为供试品溶液。 将3种溶液按拟定的色谱条件分别进样。结果见表2。表2 3种溶剂用量测定结果（略） 结果表明，以醋酸乙酯溶液洗脱，收集洗脱液150 ml较合适。　　2.2.3 流动相的选择以乙腈-水（30∶70）作为流动相进行试验，结果雷公藤甲素出峰较快，样品溶液难以得到较好分离，改用（15∶85），（20∶80），（25∶75）等雷公藤甲素均不出峰，Z后选用甲醇-水（40∶60）为流动相，雷公藤甲素出峰时间约为11 min，样品溶液分离较好，无杂质峰干扰。 　　2.3 含量测定　　2.3.1 对照品溶液的制备精密称取雷公藤甲素对照品适量，加甲醇制成每毫升含0.01 mg的溶液，作为对照品溶液。　　2.3.2 供试品溶液的制备 　　取本品30片，称定重量，研碎，精密称取10片量，加氯仿10 ml，超声10 min，加中性氧化铝1g，搅拌均匀，蒸干，上中性氧化铝柱（内径12 mm，100～200目，10 g），以醋酸乙酯溶液洗脱，收集洗脱液150 ml，蒸干，残渣加甲醇使溶解，定容至10 ml作为供试品溶液。　　2.3.3 线性关系考察精密称取雷公藤甲素对照品适量，加甲醇制成每毫升含0.0238 mg的溶液作为对照品贮备液。 精密吸取对照品贮备液1，2，4，6，8，10 ml，分别置10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别进样20 μl，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，雷公藤甲素对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程：Y=2 110.8X+3.7，r=0.999 1，结果表明雷公藤甲素对照品在0.047 6～0.476 0 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。　　2.3.4 精密度实验 　　精密吸取同一对照品溶液20 μl，重复进样5次，测定雷公藤甲素的吸收峰面积，RSD为1.84%，表明精密度良好。　　2.3.5 稳定性实验 　　精密吸取同一供试品溶液（批号040311），分别间隔2h进行测定，以雷公藤甲素的吸收峰面积进行考察，进样6次，测得RSD为2.39%，表明样品在12 h内基本稳定。　　2.3.6 重复性实验 　　分别精密称取同一批号（批号040311）样品粉末5份，每份约1 g，按供试品溶液制备方法制备，依法测定，结果样品中雷公藤甲素的平均含量为11.48 μg/g，RSD为1.36%，表明本法重复性良好。　　2.3.7 加样回收实验 　　精密称取已知含量的样品（批号040311）6份，分别精密加入雷公藤甲素对照品溶液（0.050 48mg/ml）1 ml，加入氯仿10 ml，按供试品溶液制备方法制备，依法测定。6次平均回收率为101.2%，RSD为2.1%。结果见表3。表3 加样回收实验结果（略）　　2.3.8 样品含量测定取本品30片，称定重量，研碎，精密称取10片量，按供试品溶液制备方法制备。精密吸取供试品溶液及对照品溶液各20 μl，依法进行测定，结果见表4。雷公藤甲素和雷公藤片样品的GX液相色谱图见图1～2。表4 样品含量测定结果（略）　　3 小结 本实验结果表明，HPLC法可以取代原标准中用薄层扫描法测定雷公藤片中雷公藤甲素的含量。4批样品雷公藤甲素含量均在0.01 mg/片之上，但考虑到雷公藤片片重差异，本品含量限度可暂定为：每片含雷公藤以雷公藤甲素（C37H22O14）计，不得少于0.01 mg/片。 【参考文献】 　　［1］中华人民共和国卫生部.药品标准·中药成方制剂，第16册［M］.1993：113. 　　［2］常雪灵，陈华兵，徐辉碧，等.反相GX液相色谱测定雷公藤浸膏甲素的含量［J］.分析科学学报，2003，19（4）：327.

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  wangbiaocooec 2013-08-14 00:00:00

  本次培训主要讲解了以下六个方面的内容:一、GX液相色谱法原理与方法发展二、GX液相色谱仪的原理、结构、使用和维护三、样品制备四、色谱柱的原理、选择及维护五、GX液相色谱数据处理及定性与定量分析六、GX液相色谱仪在各领域的应用由于GX液相色谱适于分析沸点高、相对分子量大，受热易分解的不稳定的有机化合物、生物活性物质以及多种天然产物，而这些化合物约占所有有机化合物的80%，因此，GX液相色谱仪具有广泛的使用范围，对于有机监测工作也就非常重要。而GX液相色谱仪的维护又决定了工作效率，因此为了能更好的更快速的完成监测工作，必须要懂得维护仪器，当然也必要的学习仪器的一些基本维修技术。对于经常遇到的堵塞问题是由于磷酸盐缓冲液在管路中沉积导致，解决办法就是每次做完实验先经纯水再经甲醇冲洗。色谱柱是GX液相色谱仪的核心部分，它的好坏直接影响到样品分离度的好坏，为了延长HPLC液相泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，必须注意以下几方面的事项：1、防止任何固体微粒进入HPLC液相泵体，因为尘埃或其它任何杂质都会磨损HPLC液相柱塞、HPLC密封环、HPLC液相缸体和HPLC液相单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相Z好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是过滤，可采用Millipore 滤膜（0.2um 或 05um） 等滤器。2、流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是HPLC停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含有缓冲液的流动相留在HPLC液相泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静止，就可能析出盐的微小晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏HPLC密封环和HPLC柱塞等。因此，必须HPLC泵入纯水充分清洗后，再换成适合于HPLC色谱柱保存和有利于HPLC泵维护的溶剂（对于反相键合固定相，可以是甲醇或甲醇和水）。 3、HPLC泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相用完，否则HPLC空泵运转也磨损HPLC柱塞、HPLC密封环或HPLC缸体Z终产生漏液。4、HPLC输液泵的工作压力不要超过规定的Z高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。5、流动相应先脱气，以免在HPLC泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡HPLC泵就无法工作。而一些常见故障的原因和解决办法也是得掌握的：1、没有流动相流出，又无压力指示。原因可能是HPLC泵内有大量的气体，这时可打开泄压阀，使HPLC泵在较大的流量（5ml/min）下运转，将气泡排尽，也可用一个50ml的注射器在泵出口处帮助抽出气体。另一个原因可能是HPLC密封环磨损，需更换。2、HPLC压力的流量不稳。原因可能是气泡，需要排除，或者是单向阀内有异物，可以卸下HPLC单向阀，浸入丙酮内，进行超声清洗。有时有可能是砂滤棒内有气泡或被盐的微小晶体粒或滋生的微生物部分堵塞，这时卸下砂滤棒浸入流动相内，超声除气泡，或将砂滤棒（片）浸入稀酸（如4mol/L硝酸）内迅速除去微生物或将盐溶解，再立即清洗。3、HPLC压力过高的原因，是管路被堵塞，需要清除或清洗。压力降低的原因则可能是管路有泄漏。检查堵塞或泄漏时可逐段进行。在管路中存在气泡会造成色谱图上出现尖锐的噪声峰，严重时会造成分析灵敏度下降；气泡变大进入流路或色谱柱时会使流动相的流速变慢或不稳定，使基线起伏。因此流动相必须预先脱气，在注入样品前也应注意排出样品注射器中的空气。本次培训还指导了色谱柱的选择，只有选择合适的色谱柱才能取得很好的色谱峰，也就能很好的定性及定量分析。如果色谱柱经过一段时间的使用后有凹陷的情况，也可以自行填补，即打开柱头，以相同或者相似的填料将凹陷的部分填平。对严重污染的柱子可以掉头使用，但必须将连接检测器的一端断开，将污染物质冲走，若基线还是有杂峰，也可以进行挖补，往往可基本恢复。

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