为什么传统刚果红染色法会出现菌落混杂现象

（一）培养基对微生物的选择作用

　　在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时YZ或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。

（二）测定微生物数量的常用方法

1、稀释涂布平板法

2、显微镜直接计数法

思考：如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？

　　先统计3个平板，并计算出平板菌落数的平均值，然后计算：每克样品中的菌落数=（某稀释度下平板上生长的平均菌落数÷涂布平板时所用的稀释液的体积）×稀释倍数。

（三）实验设计——土壤中某样品细菌的分离与计数

实验的具体操作步骤如下：

1、土壤取样

　　从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。

2、制备培养基

　　准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。

3、微生物的培养与观察

　　依次等比稀释至107稀释度，并按照由107至103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。

　　将涂布好的培养皿放在30℃下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。

　　挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生颜色反应。

4、细菌的计数

　　当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

思考：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？

　　这是因为土壤中各类微生物的数量（株/g）是不同的，因此，为了获得不同类型的微生物，就需要不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。

（四）刚果红染色法的原理

　　刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红——纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为ZX的透明圈，通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

（五）分离土壤中纤维素分解菌的实验设计

实验的具体操作步骤如下：

1、土样采集

　　土样采集的方法与上一实验设计中的类似。土样的采集要在富含纤维素的环境中进行，这是因为在纤维素含量丰富的环境中，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。

2、选择培养

　　选择培养需要的仪器有：250mL锥形瓶、无菌称量瓶、药匙、1mL和10mL的移液管、天平、摇床、温度计等。

　　培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在250mL锥形瓶中装入30mL培养基，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层包装纸（或报纸），用线绳扎紧，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。

　　选择培养的操作：称取土样20g，在无菌条件下加入装有30mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在30℃下振荡培养1～2d，至培养基变混浊。此时可以吸取0.1mL培养液进行梯度稀释和涂布平板，也可以重复选择培养的步骤一次，然后再进行梯度稀释和涂布平板。

3、刚果红染色法分离纤维素分解菌

　　这一步所需要的仪器有：无菌培养皿、涂布器、1mL移液管，装有9mL无菌水的20mL大试管，温箱等。

　　培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在500mL三角瓶中装入200mL培养基，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。

　　倒平板操作：将灭菌后的固体培养基熔化，按无菌操作的要求，在无菌的培养皿中倒入15～20mL培养基，凝固后待用。

　　制备菌悬液：按照本ZT课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释，稀释Z大倍数至106。

　　涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1mL，滴加在平板培养基上，用涂布器将菌液涂布均匀，在30℃倒置培养，至菌落长出。每个稀释度下需涂布3个平板，并注意设置对照。

　　刚果红染色法：

　　常用的刚果红染色法有两种，一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。

　　方法一　在长出茵落的培养基上，覆盖质量浓度为1 mg／mI。的CR溶液，10～15 min后，倒去CR溶液，加入物质的量浓度为l mol／I。的NaCI溶液，15 min后倒掉NaCl溶液，此时，产生纤维素酶的茵落周围将会出现透明圈。

　　方法二　配制质量浓度为10 mg／mI。的CR溶液，灭菌后，按照每200 mI。培养基加入1 mI。的比例加入CR溶液，混匀后倒平板。等培养基上长出茵落后，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈。