求助：纤维素合成酶 酶活性测定方法

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  兜纪诘司1869 2017-01-07 00:00:00

  酶活力测定常用的方法有终点法和动力学方法两类。 终点法 测定完成一定量反应所需的时间，如α-淀粉酶的活力测定。因为碘对淀粉呈现蓝色反应，当淀粉溶液中加入淀粉酶后，碘的蓝色反应消失而呈现红棕色；碘对淀粉颜色反应消失的时间可表示淀粉酶活力的大小。碘对淀粉颜色反应消失花的时间越短，表示酶的活力越高。 动力学方法 测定一定时间内所起的化学反应量。 ①比色法 如果酶反应的产物可与特定的化学试剂反应而生成稳定的有色溶液，且生成颜色的深浅与产物的浓度在一定的范围内有线性关系可用此法。如蛋白酶的活力测定：蛋白酶可水解酪蛋白，产生的酪氨酸可与福林试剂反应生成稳定的蓝色化合物，在一定的浓度范围内，所生成蓝色化合物颜色的深浅与酪氨酸的量之间有线性关系，可用于定量测定。 ②量气法 主要用于有气体产生的酶促反应。如氨基酸脱羧酶、脲酶的活力测定。产生的二氧化碳量可用特制的仪器如瓦氏呼吸仪测定之。根据气体变化和时间的关系，即可求得酶反应的速度。 ③滴定法 如果产物之一是自由的酸性物质可用此法。如脂肪酶催化脂肪水解，脂肪酸的增加量代表脂肪酶的活力。 ④分光光度法 利用底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。几乎所有的氧化还原酶都使用该法测定。如还原型辅酶Ⅰ(NADH2)和辅酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在该波长下无吸收，脱氢酶类可用该法测定。该法测定迅速简便，自动扫描分光光度计的使用对酶活力的快速准确的测定提供的极大的方便。 ⑤放射测量法 是酶活力测定中较常用的一种方法。一般用放射性同位素标记底物，在反应进行到一定程度时，分离带放射性同位素标记的产物并进行测定，就可测知反应进行的速度。常用的同位素有3H，14C，32P，35S，131I等。如脲酶，将底物尿素用14C标记，产生的带放射性的CO2气体可用标准计数法进行测定。 ⑥酶偶联分析 某些酶本身没有合适的测定方法，但可偶联另一个酶反应进行测定。其基本方法为：应用某一高度专一性的工具酶使被测酶反应能继续进行到某一可直接连续且简便准确测定阶段的方法。如：被测E1反应的产物B是某一脱氢酶(E2)的底物，向反应体系中加入足量的脱氢酶和NAD+或NADPH+，使反应由A经B继续进行到C，然后测定NADH或NADPH的特征吸收光谱的变化，即可间接地测定E1的活力大小。如己糖激酶的活力测定即应用这一方法。注意：使用该法要求指示酶必须很纯，且具有高度的专一性，以免干扰反应而给测定带来麻烦。

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