细菌内毒素检查法(定量检测)之光度测定法

光度测定试验应在特定的仪器中进行，温度一般为37℃±1℃。
为保证浊度和显色试验的有效性，应预先进行标准曲线的可靠性试验以及供试品溶液的干扰试验。当试验环境中发生了任何可能影响检测结果的改变时，试验的有效性应重新检测。
标准曲线的可靠性试验
标准曲线的制备 用标准内毒素配成溶液并制成至少3个浓度的稀释液（稀释度不得大于10），Z低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。每一稀释步骤的混匀时间同凝胶法，每一浓度至少做3支平行管。同时要求做2支阴性对照。当阴性对照在设定的时间内不发生反应，将全部数据进行线性回归分析。
根据线性回归分析，标准曲线的相关系数（r）的值应该大于或等于0.980，试验方有效。否则须重新试验。
干扰试验
选择标准线中点或一个靠近中点的内毒素浓度。按表4制备溶液A、B、C和D。供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等，参照所用仪器和试剂的有关说明进行。每种溶液至少做2个平行管。
表4 光度测定法干扰试验的制备

编号 内毒素浓度 配制内毒素的溶液 平行管数
A 无 供试品溶液 不少于2个
B 标准曲线的中点（或附近点）的浓度（设为λm） 供试品溶液 不少于2个
C 至少3个浓度（Z低一点设定为λ） 检查用水 每一浓度不少于2个
D 无 检查用水 不少于2个

注 A：稀释倍数未超过MVD的供试品溶液。
B：加入标准曲线中点或靠近中点的一个已知内毒素浓度的，且与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液。
C：如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的，用于制备标准曲线的标准内毒素溶液。
D：阴性对照。
按所得线性回归方程分别计算供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量Ct和Cs，再按下式计算该试验条件下的回收率（R）。
R=(CS-Ct)/λm×
当内毒素的回收率在50%~200%之间，则认为在此该试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。
当内毒素的回收率不在指定的范围时，须按“凝胶法干扰试验”中的方法去除干扰因素。并要重复干扰试验来验证处理的有效性。
检查法
按“光度法的干扰试验”中的操作步骤进行检测。
使用溶液C生成的标准曲线来计算溶液A的每一平行管的内毒素浓度。
试验必须符合以下三个条件方为有效：
（1）系列溶液C的结果要符合“光度技术预试验”下“标准曲线的可靠性试验”中的要求。
（2）用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后，计算出的内毒素的回收率要在50%-200%的范围内。
（3）溶液D（阴性对照）在规定的反应时间内未检测出内毒素。
若供试品溶液所在平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数和浓度后，小于规定的内毒素限值，判供试品符合规定。若大于规定的内毒素限值，判供试品不符合规定。
（注：本检查法中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微孔板中的孔。）（厦门--鲎试剂）