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- vg枯产喏 2008-05-23 00:00:00
- 我觉得你应该说你要表达纯化什么蛋白吧 现在表达纯化一个蛋白不是那么难的
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- 白巧克力0603 2008-05-23 00:00:00
- 恭喜你选择了一个超级难的研究课题。有的人究其一生都没有完成某种蛋白的表达和纯化。祝你成功。 建议到图书馆找找相关的书来看一看,我记得原来看过的书都是超厚的,好多还是英文版的。
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- 墨尐颜爬 2017-11-25 19:57:29
- 蛋白表达纯化已经是非常经典简单的实验了,没有LSS说的那么吓人。 说说我的蛋白表达纯化以及下面的单抗制作工作总体设计概要吧: 1 首先要知道你要纯化蛋白的编码DNA序列,查阅相关文献,看目的基因在那些细胞或者组织中高表达,进而设计该基因的引物,扩增出目的DNA片段的ARF。这一布叫目的基因片段的获取 2 构建表达载体:根据你获得的基因本身的特性确定原核或者真核载体中表达,这一步的主要问题就是构建带有目的基因的质粒,导入表达系统中。一般原核表达时间短,成本低,表达量大,常优先考虑;但是有些基因在E coli中就是表达不出,可能是密码子优化等出现问题,也或者是由于想纯化得到更好的活性蛋白的考虑(原核的蛋白折叠系统显然没有真核的好),有很多研究者选择在毕赤酵母中表达。(我手里就有相关资料,因为以前做过表达纯化及后来的单抗制备),这一步再强调一下,优化密码子对于蛋白的成功表达很重要 3 载体构建好了,下面就是重组蛋白的表达了。这一过程涉及到用多少的诱导剂,诱导多少时间才能得到Z多的蛋白的问题,即优化表达条件。就是在上述不同量诱导剂诱导条件下,取菌体上清(分泌型)或者破碎细胞(胞内表达的蛋白)电泳,看是否得到目的分子量大小的蛋白 4 蛋白表达成功,下面是根据蛋白质本身亲水/疏水,电荷带电特性等确定蛋白纯化的方法。一般步骤:离心,取蛋白所在的相 如果是分泌表达的蛋白,则取上清,超滤,没有超滤仪器可以用透析袋等代替,用离子交换柱层析。基本上这一步能得到纯化的95%的蛋白,电泳鉴定基本不会看到有杂带出现。如果还是纯度不符合要求,可以在表达蛋白Z初在构建表达载体质粒的时候在蛋白的ORF后面加上HIS-标签,这样得到的蛋白不但可以用于HIS柱的进一步纯化,在不确定自己的融合蛋白是否有表达的时候,也可以单单用抗HIS的抗体做一WB,分析确认目的蛋白是否表达,这是蛋白表达的常用手段。 5 经过纯化后的蛋白仍然含有一部分无机盐,如果需要的话可以将蛋白经真空冻干机冻干,得到纯蛋白。 我们实验室做出来的一个蛋白,编码序列GC含量高75达%,但是功夫不负有心人,只要你想做那件事情,积极的寻找解决问题的手段,总会搞定的,没有跨不过的坎。如果坎太宽,搭桥解决总行。
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