SV40 DNA是一个超螺旋的、环状的双链DNA,它的全核苷酸顺序(5224个碱基对)已发表。全顺序的测出,能够在基因组上确定已知基因的位置。基因组中至少有15.2%是不翻译成多肽的。全顺序可分为早转录区和晚转录区两大区段。早转录区编码两个蛋白质——t抗原和T抗原,二者的基因起始于同一位置,并共用一段约300个碱基对长的片
1 . SV40 的复制原点及其识别 :
SV40 只有一个复制原点,病毒早期感染表达一个 DNA 结合蛋白,称作 T 抗原 ( T antigen )。在 ATP 的参与下, T 抗原以两个六聚体的方式结合到复制原点的核心区域,导致 T 抗原结合位置上 AT 富含区及反向末端重复序列的 DNA 结构发生改变,使反向末端重复序列发生扭曲。而广泛稳定的解链通常需在单链 DNA 结合蛋白,即复制蛋白 A(Rp-A) 的参与下形成复制泡( replication bublle )。此时 T 抗原固有的 3' → 5' 解旋酶活性协调把 DNA 从原点核心向两个方向解旋。由于 DNA 合成的方向为 5' → 3' ,因此其合成的子链一条为连续的先导链,一条是不连续的后随链。
2 .先导链合成:
DNA 聚合酶α - 引物酶与 Rp-A 和 T 抗原在 SV40 复制原点的结合形成 合成前复合物 ( presythesis complex ) , 标志着先导链合成的开始。复制叉形成后,两个亲本链上先导链的合成通常是不对称的。这是由于在引物酶合成先导链 6 ~ 9 个核苷酸的 RNA 引物后 ,DNA 聚合酶 α 将进一步延伸左向先导链,形成 冈畸片段 ( Okazaki fragment )。链延伸到原点左侧,原点右侧的模板暴露,另一个合成前复合物与之结合,开始右向复制。随后细胞的 RF-C 、 PCNA 和 DNA 聚合酶δ结合在冈畸片段 3' 末端完成先导链的延伸。其中 PCNA 是 DNA 聚合酶δ的加工因子,不仅为连续的先导链合成过程所必需,而且在 SV40 DNA 复制的整个过程中起着重要作用。 PCNA 就如同一个在 DNA 模板上“滑行的夹子”,作为 DNA 聚合酶的移动平台。 PCNA 本身是个闭环结构,不能直接“结合到” DNA 双螺旋链上,需要有 RF-C 的参与。这是由于 RF-C 与 PCNA 结合后,在 ATP 的作用下 PCNA 闭环瞬时打开,因此 RF-C 常被称作“ 上夹蛋白 ”。 RF-C 与 PCNA 的结合可YZ DNA 聚合酶 α 的作用,使 DNA 聚合酶 α - 引物酶复合物解体,而 DNA 聚合酶δ的结合使先导链的合成得以继续。 SV40 DNA 模板在复制原点及两个复制叉上解旋,在复制叉前方形成正超螺旋结构。这种结构对病毒 DNA 的复制是不利的,需要拓扑异构酶 I 或 II 来消除正超螺旋结构,使复制叉继续移动。
3 .后随链合成:
SV40 DNA 复制过程中,后随链的引物及冈畸片段的合成与先导链 DNA 合成一样,也是由 DNA 聚合酶 α - 引物酶作用的结果。 DNA 聚合酶δ的作用是结合于冈畸片段的 3' 末端,负责链的延伸。后随链的合成通常是在复制原点一侧的多个位置上同时开始,沿 5' → 3' 方向合成不连续的 DNA 片段,随后 RNaseH 及 5' → 3' 外切酶 Fen1 降解 DNA 片段上的 RNA 引物,留下的间隙由 DNA 聚合酶δ修复,Z后 DNA 连接酶将这些 DNA 片段连接在一起。
4 .复制终结及产物的转换:
闭环 SV40 DNA 的复制终点出现在两个复制叉会合后,位于距复制原点的约 1800 位置。 DNA 复制完成后形成的闭环链体结构需要拓扑异构酶 II 环链,即首先一条 DNA 分子发生双链断裂,而另一条闭环双链 DNA 分子从此断裂处通过,环套结构被解开,然后在 ATP 的作用下断裂处被重新粘接上,Z终形成两个独立的 SV40 闭环子链 DNA 。
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