有谁能详细说一下全基因组Bisulfite Sequencing的流程

亚硫酸氢钠测序法(bisulfite genomic sequencing)
直接测序法是建立在MSP基础上进一步深入研究CpG岛各个位点甲基化情况的方法.重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲基化因素的影响)所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶.Z后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化.此方法一种可靠性及精确度很高的方法，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态.在寻找有意义的关键性CpG位点上，有其他方法无法比拟的优点.测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序列为引物配对区，所以能够同时扩增出甲基化和非甲基化靶序列.它的不足是耗费时间和耗资过多，至少要测序10个以上的克隆才能获得可靠数据，需要大量的克隆及质粒提取测序，过程较为繁琐、昂贵.
diyi部分 基因组DNA的提取.
这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以.DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的.
此步ZD在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要.因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者.
使用两者的细节：
1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；
2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml.否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了.两者均于-20度保存.
验证提取DNA的纯度的方法有二：
1：紫外分光光度计计算OD比值；
2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳.
我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰.
第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌.
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；
2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；
3： 42℃水浴30min；
水浴期间配制：
4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）
5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，Z终体积为5ml.这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心.PH一定要准确为5.0.加520ul至上述水浴后溶液中.
6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液.
7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化.
8：50℃避光水浴16h.
一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适.
这一步细节：
1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰Z多可至4ug.
2：所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确.
3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收.
4：水浴Z好达16小时，虽可以短至8小时，但后者修饰会有不完全.
第三部分 修饰后DNA纯化回收
EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的.
1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中.
2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega，A7280）
1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；
2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合；
3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓，如果有真空负压吸引器，使用起来很方便；如果没有，需要自备3ml-5ml注射器.将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后，将上述混合物用移液器移至针筒内，用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液.加针栓，轻轻加压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积.
4）将注射器与小柱分离后拔出针栓，再将针筒与小柱连接，向针筒内加入2ml 80％的异丙醇，插入针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出.此为洗涤步骤.
5）将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上，离心12000rpm，2min，以甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥.此时，修饰后DNA处于与树脂结合状态.
6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上，移液器加50ul预热好的DDW，室温放置5min.
7）离心12000rpm，20s，此为洗脱步骤，此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液，终体积为50ul.
3：加5.5ul 新鲜配制的3M NaOH，室温放置15min.
4：加33ul 10M乙酸铵，以中和NaOH，使溶液PH于7.0左右.
5：加4ul 10mg/ml糖原，此作为沉淀指示剂，因为其与乙醇混合后可产生沉淀，便于以后离心后辨别回收物的位置，以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走.其实，加入这些糖原究竟能起多大作用，不好说.不过有国产糖原卖，包装不大，也很便宜，买来一用，算严格遵守文献的步骤吧.
6：加270ul 冰无水乙醇，置于-20度，过夜沉淀.有人为沉淀Z短可至2小时，但我认为时间长些可能会更好.并且做到此步骤时，一般会到中午，如果样本多的话要到下午，不妨放置过夜，日程可以轻松些，顺便做些其他试验.如果想当天做完，没有问题，但我认为Z好多沉淀些时候，至少6小时吧（这是经验，我做过Z少6小时，也是可以的，再短就不敢发表意见了）
7：4度，12000rpm离心，30min，倒去上清液，收集沉淀.不必吸净.
8：加500ul 70%乙醇，不要将沉淀吹打起来，只要把乙醇加上即可.轻柔倾斜EP管，旋转一圈，再次离心，4度12000rpm，5min.离心后倒掉上清，再加同量乙醇，同样再做一遍.此为洗涤步骤，共2次.
9：倒掉上清，并常温简短离心后，将附壁乙醇离至EP管底，移液器小心将残余液体吸净，室温干燥5min，或沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入20ul- 30ulDDW，溶解沉淀.至此，已完成了修饰后DNA的纯化回收，所得为修饰后DNA溶液，可用于此后的进一步实验.
10：-20℃保存DNA溶液.
此步细节：
1：在使用注射器时，一定要用力均匀且轻，如使用暴力，会将小柱内的薄膜挤破，失去作用.
2：乙酸铵、糖原不需新鲜配制，糖原配好后放在-20度保存，乙酸铵室温即可，因为这样浓度的乙酸铵非常难溶，一旦放在4度，取出用时也会有很多溶质析出.
3：异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制，但如果用量大，现场配也很方便.
此步关键是在树脂与DNA的结合上，这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性.因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH，如前一步没做好，此步树脂不能与DNA很好结合，将会带来灾难性后果，即DNA随着液体被挤出了，洗脱时实际已没有任何DNA了.
第四部分 修饰后DNA用于PCR
这一步也没有悬念.我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：
1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度，我曾设计过几对引物，并且试验了一下，但以失败告终.如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多，自己设计引物没有问题.如果不是这样，还是参考文献更好些.首先查阅SCI分值高的文献，然后是实验室的文献，如果国内有做的，更好了，可以直接联系咨询.查到序列后，一定要和Genbank中的序列进行比对，防止有印刷错误造成的个别碱基的差别.然后再到google上搜一下，看用的人多否，体系条件是否一样.用的人多、体系条件一样，表明可重复性比较强.我也是按此行事，算比较顺利.
2：Taq酶问题：有文献用高保真的金牌 Taq（Platinum），但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适，一般的热启动酶是可以的.我开始使用的是Takara的LA Taq，很好用，配有10x含mg++的LA缓冲液.有时候用没了，暂时以Takara 的普通Taq酶也可以.如何选择，可以根据自己的情况.初作者还是用好一点的酶.
3：PCR的条件：变性一般都选择95度，3min.其余我感觉还是根据文献，退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试.一般和文献报道差别不大.只是扩增片断特异性的问题.建议根据文献.
4：做PCR的EP管Z好选择进口的，壁薄且厚度均匀，这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液，使体系真正在所设定的温度下运行.
5：PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了，Z好一直用此仪器继续.不同的仪器“脾气”也不一样，但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好，留有空隙，我认为会影响温度的传递.
这一部分有些啰嗦，只是个人一些不成熟经验.有疑问处，请大家指出，交流.今天先到这里，现写一些内容，比较费劲，总是不能一挥而就.望见谅.歇息一会准备写Z后蓝白斑筛选克隆这一部分.
第五部分 PCR产物的凝胶回收
这一步比较简单，可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒，国产的就很好、价格也合理，比如TIANGEN的产品（用过）.把切下来的胶按说明书操作即可.
几个细节：
1：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，要使用新配的电泳液.凝胶浓度1%-2%均可.
2：凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置，切取目的片断所在位置的凝胶，尽量小，保证特异性.
3：紫外照射时间不能过长，否则对DNA有损伤.
4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20度，在数月内是很稳定的.
第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选
1：连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）
15ul体系
T-easy 1ul
Ligase 1ul
2xbuffer 7.5ul
DNA 5.5ul
4度，过夜.
2：连接产物的转化
1）-70度冰箱内取出感受态细菌，融化后置于冰上；
2）连接产物15ul 全部加入，至于冰上30分钟；
3）42度， 90秒钟；
4）冰上2分钟；
5）800ul LB培养基；
6）280rpm，37度，摇床45分钟（将管放水平了摇，保证菌液摇匀）；
7）8000rpm，1分钟；在超净台内去上清，留100-150ul；
8）涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）
先涂：X-gar 35ul
IPTG 25ul
后涂：混悬液
过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点，取白色斑点，尤其是蓝色斑点周围的白色斑点，此处自联率较低.
3：取白斑，划种于新板上
新板：先涂：X-gar 35ul
IPTG 25ul
然后于板底划出分区，进行标记.根据需要，一般一板作50个克隆没有问题.
针头挑白斑划2道于板上相应区域内.
37度，孵箱过夜.
4：联系测序公司送测序.一般一个克隆在35-45元.
这一部分的细节：
1：涂板要均匀，保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上；
2：不要让蓝白斑长得太满，否则选取克隆时容易一下挑2个.