原代细胞培养吗?
你看看这个:
1. 组织修剪、漂洗:修剪去除血管等杂组织,D—Hanks液中漂洗数次,以除去血块等。
2. 剪切:将心室肌用锋利的眼科剪反复剪切组织至剪成1~2mm3小块,在剪切过程中,可以适当向组织中滴加1~2滴培养液,以保持湿润。
3. 消化:将组织小块转移至100ml的玻璃瓶中,再加入30~50倍组织量并预温37℃的0.08%胰酶消化液,37℃摇床消化6min左右。
4. 细胞分离:消化完毕,用吸管轻轻吸吹几下,使组织小块散开,静置2min后,吸取上面的混悬液(弃去第1次的混悬液),经140目尼龙网膜过滤至盛有终止液试管中,1000rpm,离心10分钟,弃去上清,加适量的培养液悬混。在装有组织小块的玻璃瓶中再加入30~50倍组织量并预温37℃的0.08%胰酶消化液,重复第4、5步骤,直至大部分组织小块消失。
5. 细胞计数:将上述获得的细胞悬液,吸出少许,适当稀释,加台盼蓝溶液染色,用红血球计数板计数活细胞和死细胞,计算细胞密度和存活率。
6. 细胞接种:将细胞接种至30ml的培养瓶中,每瓶6×105,用含15%小牛血清的DMEM培养液培养。
7. 培养:5%CO2、37℃培养箱培养12h,显微镜下可见细胞贴壁,呈多角形,培养24h,镜下见细胞已连结在一起,部分细胞开始搏动。
8. 换液:培养3~5d,细胞换液。