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基因扩增属于分子遗传吗?

ldj98636 2016-09-12
基因扩增属于分子遗传吗?... 基因扩增属于分子遗传吗?
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goolring
基因扩增技术
又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法,是基因扩增技术的一次重大革新。可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍,从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力,能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品,因而此方法立即在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域广泛应用和迅速发展。由于PCR具有敏感性高、特异性强、快速、简便等优点,已在病原微生物学领域中显示出巨大的应用价值和广阔的发展前景。
特异性高
首次报导的PCR所用的DNA聚合酶是大肠杆菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段,其酶活性在90℃会变性失活,需每次PCR循环都要重新加入Klenow大片段,同时引物是在37℃延伸(聚合)易产生模板—引物之间的碱基错配、致特异性较差,1988年Saiki等从温泉水中分离到的水生嗜热杆菌中提取的热稳定的Taq DNA聚合酶,在热变性处理时不被灭活,不必在每次循环扩增中再加入新酶,可以在较高温度下连续反应,显著地提高PCR产物的特异性,序列分析证明其扩增的DNA序列与原模板DNA一致。
扩增过程中,单核苷酸的错误参入程度很低、其错配率一般只有约万分之一,足可以提供特异性分析,选用各型病毒相对的特异寡核苷酸引物。PCR能一次确定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物检测病妇宫颈刮片细胞可以发现部分病人存在HPV11和HPV16两型的双重感染。

基因扩增技术高度敏感
理论上PCR可以按2n倍数扩增DNA十亿倍以上,实际应用已证实可以将极微量的靶DNA成百万倍以上地扩增到足够检测分析量的DNA。能从100万个细胞中检出一个靶细胞,或对诸如病人口液等只含一个感染细胞的标本或仅含0.01pg的感染细胞的特异性片段样品中均可检测。

基因扩增技术快速及无放射性
一般在2小时内约可完成30次以上的循环扩增,加上用电泳分析。只需3-4小时便可完成,不用分离提纯病毒,DNA粗制品及总RNA均可作为反应起始物,可直接用临床标本如血液、体液、尿液、洗液、脱落毛发、细胞、活体组织等粗制的DNA的提取液来扩增检测,省去费时繁杂的提纯程序,扩增产物用一般电泳分析即可,不一定用同位素,无放射性易于推广。

基因扩增技术简便
扩增产物可直接供作序列分析和分子克隆,摆脱繁琐的基因方法,可直接从RNA或染色体DNA中或部分DNA已降解的样品中分离目的基因,省去常规方法中须先进行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的组织或切片亦可检测。如在PCR引物端事先构建一个内切酶位点,扩增的靶DNA可直接克隆到M13,PUC19等相应酶切位点的载体中。

基因扩增技术可扩增RNA或cDNA
先按通常方法用寡脱氧胸苷引物和逆转录酶将mRNA转变成单链cDNA,再将得到的单链cDNA进行PCR扩增,即使mRNA转录片段只有100ngcDNA中的0.01%,也能经PCR扩增1ng有242碱基对长度的特异片段,有些外显子分散在一段很长的DNA中,难以将整段DNA大分子扩增和做序列分析。若以mRNA作模板,则可将外显子集中,用PCR一次便完成对外显子的扩增并进行序列分析。
2 0 2016-09-13 0条评论 回复
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