用CTAB法提取细菌DNA的过程

一、针对一些不易于提取的细菌的方法:
试验试剂：
抽提缓冲液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）
100mMTris-HCl(pH8.0)
25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl
10MLiCl
2MLiCl
DEPC-water（YZRNA酶活性）
3MNaAc(pH5.2)
96%乙醇
70%乙醇
试验步骤：
1、抽提缓冲液65℃预热。
2、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min。
3、加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，以12000rpm，离心10min。
4、取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，以12000rpm，离心10min。
5、重复再作一次步骤4。
6、加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙
醇），－20C下沉淀。
7、以2000rpm，离心10min。
8、弃上清，以70％乙醇条洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于
100ml 水中。
二、较为常用的细菌DNA提取方法：
实验步骤：
1、将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。
2、取1.5ml 培养物12000rpm离心2min。
3、沉淀中加入567ul 的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入
30ul10%SDS和15ul 的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.
4、加入100ul5mol/LNaCl 充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl 溶液，混匀
后再65℃温育10min。
5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min将上清转入一只新管中，
加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。
6、沉淀用1ml 的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇．
三、菌液直接PCR
菌液直接PCR只需要用枪头沾取菌落，或者加入1-2微升菌液即可。预变性时间可稍微延长。如果引物特异性好，效果与用DNA模板差不多。