产淀粉酶菌种的紫外诱变及平板的初筛

紫外线诱变选育α-淀粉酶高产菌株

一、实验目的
1. 学习菌种的物理因素诱变育种基本技术。
2. 通过诱变技术筛选出高产ɑ-淀粉酶的菌株。
二、实验原理
紫外线是一种Z常用有效的物理诱变因素，其诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成突变型。紫外线诱变一般采用15W或30W紫外线灯，照射距离为20~30 cm，照射时间依菌种而异，一般为1~3 min，死亡率控制在50％~80％为宜。被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯种的出现。同时，对于细菌细胞的生理状态，要求培养至对数生长期为Z好。
本实验以紫外线处理产淀粉酶的枯草杆菌，通过透明圈法初筛，选择淀粉酶活力高的生产菌株。
三、实验材料
⑴ 菌种 产淀粉酶枯草芽孢杆菌
⑵ 器材 装有15W或30W紫外灯的超净工作台、电磁力搅拌器（含转子）、低速离心机、培养皿、涂布器、10mL离心管、（1、5、10mL）吸管、250mL三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球
⑶ 培养基和试剂
① 无菌水、75%酒精
② 0.5％碘液 碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL。先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘片全部溶解后，加足水即可。
③ 选择培养基 可溶性淀粉2g，牛肉膏1g，NaCl 0.5g，琼脂2g，蒸馏水100mL，pH6.8～7.0，121℃灭菌20min。
④ 肉汤培养基 牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，蒸馏水100mL，pH7.2～7.4，121℃灭菌20min。
四、实验步骤
⑴ 菌体培养 取枯草芽孢杆菌一环接种于盛有20 mL肉汤培养基的250mL三角瓶中，于37℃振荡培养12h，即为对数生长期的菌种。
⑵ 菌悬液的制备 取5mL发酵液于10mL离心管中，以3000r/min离心10min，弃去上清液。加入无菌水9mL，振荡洗涤，离心10min，弃去上清液。加入无菌水9mL，振荡均匀。
⑶ 诱变处理 将菌悬液倾于无菌培养皿中（内放一个磁力搅拌棒），置电磁力搅拌器上于超净工作台紫外灯下（距离30cm）照射0.5~1min。
⑷ 取0.1~0.2mL诱变后菌悬液于选择培养基平板上，用涂布器涂匀。置37 ℃暗箱培养48h。
⑸ 在长出菌落的周围滴加碘液，观察并测定透明圈直径（C）和菌落直径（H），挑选C/H值Z大者接入斜面保藏。
五、注意事项
1. 紫外线对人体的细胞，尤其是人的眼睛和皮肤有伤害，长时间与紫外线接触会造成灼伤。故操作时要戴防护眼镜，操作尽量控制在防护罩内。
2. 空气在紫外灯照射下，会产生臭氧，臭氧也有杀菌作用。臭氧过高，会引起人不舒服，同时也会影响菌体的成活率。臭氧在空气中的含量不能超过0.1％~1％。