急用！一论述题:如何克隆一个功能性基因，如何在原核系统中GX表达？

你的题目关键是解决两个问题：一是功能性基因在原核生物中的表达；二是如何GX进行表达。
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1、原核生物只有一种RNA 聚合酶（真核细胞有三种）识别原核细胞的启动子，催化所有 RNA的合成。
2、原核生物的表达是以操纵子为单位的。操纵子是数个相关的结构基因及其调控区的结合，是一个基因表达的协同单位。调控区主要分为三个部分：操纵基因、启动子及其他有调控功能的部位。
3、功能性基因一般是真核生物所具有的基因，而真核生物基因基本具有外显子和内含子等结构。原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统，因此当克隆的含有内含子的真核基因在原核细胞中转录成 mRNA 前体后，其中内含子部分不能被切除。
4、原核生物基因的控制主要在转录水平。这种控制要比对基因产物的直接控制要慢，对RNA 合成的控制有两种方式：一是起始控制(启动子控制)，二是终止控制(衰减子控制)。
5、在大肠杆菌（大多工程菌都是使用大肠杆菌）mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及同16S核糖体RNA 3'末端碱基互补的序列，即 SD 序列，而真核基因则缺乏此序列。因此，真核基因本身的mRNA前端部分不能直接使用，需要进行一定的修饰。

将外源基因在原核细胞中表达，必须考虑表达载体、外源基因的性质、原核细胞的启动子和 SD 序列、阅读框架及宿主菌调控系统等基本条件，也就是说必须满足以下条件：
⑴通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白；
⑵外源基因不能带有内含子，因而必须用 cDNA 或全化学合成基因，而不能用基因组 DNA；
⑶必须利用原核细胞的强启动子和 SD序列等调控元件控制外源基因的表达；
⑷外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架(open reading frame)；
⑸利用宿主细胞的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达对宿主菌的毒害。

大肠杆菌表达系统是目前应用Z广泛的表达系统，由于待表达的外源基因结构具有多样性，尤其是真核生物基因的结构与大肠杆菌基因结构之间存在较大的差异，因而在构建表达系统时必须具体情况具体分析。一般来说，GX表达外源基因必须考虑以下基本原则：
①优化表达载体的设计。为了提高外源基因的表达效率，在构建表达载体时对决定转录起始的启动子和决定 mRNA 翻译的SD序列进行优化。具体方法包括组合强启动子和强终止子；增加 SD 序列中与核糖体 16S rRNA 互补配对的碱基因序列，使 SD 序列中6～8 个碱基与核糖体16S rRNA 的碱基完全配对；根据待表达外源基因的不同情况调整 SD 序列与起始密码子 ATG 之间的距离及碱基的种类；防止核糖体结合位点附近序列转录后形成“茎环”二级结构。
②提高稀有密码子 tRNA 的表达作用。多数密码子具有简并性，而不同基因使用密码子的频率不相同。大肠杆菌基因对某些密码子的使用表现了较大的偏爱性，在几个同义密码中往往只有一个或两个被频繁地使用。同义密码子使用的频率与细胞内相应的 tRNA 的丰度呈正相关，稀有密码子的tRNA在细胞内的丰度很低。在 mRNA的翻译过程中，往往会由于外源基因中含有过多的稀有密码子而使细胞内稀有密码子的 tRNA供不应求，Z终使翻译过程终止或发生移码突变。此时可通过点突变等方法将外源基因中的稀有密码子转换为在受体细胞中高频出现的同义密码子。
③提高外源基因 mRNA 的稳定性。大肠杆菌的核酸酶系统能专一性地识别外源 DNA或 RNA并对其进行降解。对于 mRNA 来说，为了保持其在宿主细胞内的稳定性，可采取两种措施，一是尽可能减少核酸外切酶可能对外源基因 mRNA的降解，二是改变外源基因 mRNA 的结构，使之不易被降解。
④提高外源基因表达产物的稳定性。大肠杆菌中含有多种蛋白水解酶，在外源基因表达产物的诱导下，蛋白水解酶的活性可能会增加。因此，须采用多种措施提高外源蛋白在大肠杆菌细胞内的稳定性。常用的方法包括：将外源基因的表达产物转运到细胞周质或培养基中；选用某些蛋白水解酶缺陷株作为受体菌；对外源蛋白中水解酶敏感的序列进行修饰或改造；在表达外源蛋白的同时，表达外源蛋白的稳定因子。
⑤优化发酵过程。在发酵罐内工程菌生长到一定的阶段后，开始诱导外源基因的表达，诱导的方式包括添加特异性诱导物和改变培养温度等。使外源基因在特异的时空进行表达不仅有利于细胞的生长代谢，而且能提高表达产物的产率。生物因素的第三方面是提高外源基因表达产物的总量。外源基因表达产物的总量取决于外源基因表达水平和菌体浓度。在保持单个细胞基因表达水平不变的前提下，提高菌体密度可望提高外源蛋白质合成的总量。

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这题目考查的就是基因工程的步骤，详细叙述下基因工程的步骤即可。提取目的基因：主要有两条途径：如果目的基因序列已知，则用限制性内切酶从供体细胞的DNA中直接分离基因；如果序列未知，则人工合成基因。直接分离基因Z常用的方法是“鸟枪法”，用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的DNA（即外源DNA）的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来；人工合成基因的方法主要有两条：一条途径是以目的基因转录成的信使RNA为模版，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对的原则，推测出它的基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单链核苷酸为原料合成目的基因。目的基因与运载体结合：这是基因工程的核心，三种Z常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。如果以质粒作为运载体，首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。将目的基因导入受体细胞：基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌，枯草杆菌，土壤农杆菌，酵母菌和动植物细胞等。题目为原核系统，如受体细胞是细菌，一般是将细菌用氯化钙处理，以增大细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制，由于细菌的繁殖速度非常快，在很短的时间内就能够获得大量的目的基因。目的基因的检测和表达：目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。