组织培养怎么做，求步骤，求方法

要根据培养目的适当选取材料，选择原则：易于诱导、带菌少。要选取植物组织内部无菌的材料。这一方
面要从健壮的植株上取材料，不要取有伤口的或有病虫的材料。另一方面要在晴天，Z好是中午或下午取
材料，决不要在雨天、阴天或露水未干时取材料。因为健壮的植株和晴天光合呼吸旺盛的组织，有自身消
毒作用，这种组织一般是无菌的。培养材料的消毒

从外界或室内选取的植物材料，
都不同程度地带有各种微生物。
这些污染源一旦带人培养基，
便会造成
培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上。

diyi步，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。把材
料切割成适当大小，即灭菌容器能放人为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料
清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。洗时可加
入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的
物质，便于灭菌液的直接接触。当然，Z理想的清洗物质是表面活性物质
—
吐温。

第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、
70%
酒
精、消毒液、无菌水、手表等。用
70%
酒精浸
10
～
30s
。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，
加之
70%
酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料，如果实、花
蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用
70%
酒精处
理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。

第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取
1
—
2
种使用见表。第四步是用无菌
水涮洗，涮洗要每次
3min
左右，视采用的消毒液种类，涮洗
3-l0
次左右。无菌水涮洗作用是免除消毒剂
杀伤植物细胞的副作用注意：①酒精渗透性强，幼嫩材料易在酒精中失绿，所以浸泡时间要短，防止酒精
杀死植物细胞。②老熟材料，特别是种子等可以在酒精中浸泡时间长一些，如种子可以浸泡
5
分钟。③升
汞的渗透力弱，一般浸泡
10
分钟左右，对植物材料的杀伤力不大。④漂容易导致植物材料失绿，所
以对于幼嫩材料要慎用。⑤在消毒液中加入浓度为
0.08
—
0.12%
的吐温
20
或
80
（一种湿润剂），可以
降低植物材料表面的张力，
达到更好的消毒效果。
灭菌剂

使用浓度
(%)
持续时间
（
min
）

去除的难易

效
果

次氯酸钙

9~10 5~30
易

很好

次氯酸钠

2 5~30
易

很好



0.1~1 5~8
较难

Z好

KJ素

4~50mg/L 30~60
中

较好

制备外植体

将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，
叶片则不需剥皮。在操作中严禁用手触动材料。

接种和培养

（一）接种

在无菌坏境下，将切好的外植体立即接在培养基上，每瓶接种
1
－
2
个，以防止交叉污染。（二）封口

接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口。

（三）温度

培养基大多应保持在
25
℃左右，但要因花卉种类及材料部位的不同而区别对待。

增殖

外植体的增殖是组培的关键阶段，
在新梢等形成后为了扩大繁殖系数，
需要继代培养。
把材料分株或切
段转入增殖培养基中，增殖培养基一般在分化培养基上加以改良，以利于增殖率的提高。增殖
1
个月左右
后，可视情况进行再增殖。

根的诱导

继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，
必须转到生根培养基上进行生根培养。
1
个月后即可获得
键壮根系。

组培苗的炼苗移栽

试管苗从无菌到光、温、湿稳定的环境进入自然环境，必须进行炼苗。一般移植前，
先将培养容器打开，于室内自然光照下放
3
天，然后取出小苗，用自来水把根系上的营养基冲洗干净，再
栽入已准备好的基质中，基质使用前Z好消毒。移栽前要适当遮荫，加强水分管理，保持较高的空气湿度
（相对湿度
98
％左右），但基质不宜过湿，以防烂苗。

组织培养中的清洗、消毒灭菌技术

日期：
2010
年
4
月
1
日

来源：互联网

作者：植物组培网

点击：
2190

1
、
清洗

植物组织培养用的各种玻璃器皿，
特别是培养瓶和盛培养基的器皿，
一定要严格清洗，
以防油污、
重金属离子、酸、碱等有害物质残留在瓶内，影响培养物的生长。使用过的玻璃器皿应及时清洗，先将污
物如培养基、培养物倒掉，再浸入水中，然后洗涤。玻璃器皿的洗涤，可根据器皿的污染程度和性质，采
用不同的方法，通常有碱洗法和酸洗法。凡有微生物污染的器皿，必须先进行高压消毒和煮沸，以杀死菌
体，否则会产生孢子飞扬，污染环境，给组织培养带来严重困难。器皿洗净后，应烘干或晾干，放在规定
的地方，便于取用。

常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热
(
烘烧和灼烧
)
、湿热
(
常压或高压蒸
煮
)
、射线处理
(
紫外线、超声波、微波
)
、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用、甲
醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂、次氯酸钠、KJ素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要
根据工作中的不同材料不同目的适当选用湿热灭菌（培养基）培养基在制备后的
24h
内完成灭菌工序。高
压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅
内温度也随之增加。在
o
．
1MPa
的压力下，锅内温度达
121
℃。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细
菌及其高度耐热的芽孢。注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有
几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，
通电后，待压力上升到
O
．
05MPa
时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。三
次放气后，关阀再通电，压力表上升达
0
．
1-0
．
15Mpa
时，维持
15-20min
。
•
对高压灭菌后不变质的
物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间，
既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。对于一些布制品，如实验
服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌
20-30min
。高压灭菌前后的培
养基，其
pH
值下降
0.2-0.3
单位。高压后培养基
pH
值的变化方向和幅度取决于多种因素。在高压灭菌
前用碱调高
pH
值至预定值的则相反。培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时，高压灭
菌后的
pH
值变化幅度较大，甚至可大于
2
个
pH
值单位。环境
pH
值的变化大于
0.5
单位就有可能产生
明显的生理影响。
高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，
从而改变培养基的渗透压。
在
8%-20%
蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约升高
0
．
43
倍。培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使
15%-25%
的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基值小于
5.5
，其水解量更多，培养基中添加
0.1%
活性炭
时，高压下蔗糖水解大大增强，添加
1%
活性炭，蔗糖水解率可达
5%
。

灼烧灭菌（用于无菌操作的器械

）
•
在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入
95%
的酒精中，使
用之前取出在酒精灯火焰卜灼烧火菌。冷却后，立即使用。操作中可采用
250
或
500ml
的广口瓶，放入
95%
的酒精，以便插入工具。

干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具）干热灭菌是利用烘箱加热到
160-180~C
的温度来杀死微生物。由
于在干热条件下，
细菌的营养细胞的抗热性大为提高，
接近芽抱的抗热水平，
通常采用
170
℃持续
90min
来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用
耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温，达到顶定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免
妨碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭
菌能源消耗太大，浪费时间。

过滤灭菌（不耐热的物质

）一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，
不能用高压灭菌处理，
通常采用过滤灭菌方法。
可用无菌的孔径
0.20-0.45um
的硝酸纤维素膜过滤菌类，
当溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时，
常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器。使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射器的靠针管处，将待过
滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。

紫外线和熏蒸灭菌（空间）
•(1)
紫外线灭菌

在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭
菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成
死亡。紫外线的波长为
200
—
300nm
，其中以
260nm
的杀菌能力Z强，但是由于紫外线的穿透物质的
能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过
1.2m
为宜。

(2)
熏蒸灭菌

用加热焚烧、
氧化等方法，
使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，
以杀死空气和物体表
面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭
紧密，按
5
—
8ml
／
m3
用量，将甲醛置于广口容器中，加
5g/m3
高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预
先喷湿以加果。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。化学消毒剂的种类很多，它们使微生物
的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。
一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越好。另外，由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用，所
以要制成水溶状态，如与高锰酸钾。还有消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强，但石炭酸和
酒精例外