如果肝酶高，GPT206，GOT236，还能不能接受抗结核ZL呢

不能，先保肝，再抗结核ZL，2倍以上

两种药物代谢酶活性测定

一、 DDPH对大鼠肝脏微粒体CYP450及Ⅱ相结合酶活性的影响

材料和方法
1 材料
1.1 实验动物
雄性SD大鼠，体重220±20 g，由华中科技大学同济医学院实验动物ZX提供。
1.2 仪器设备
Mettler AE200电子天平（Mettler Toledo公司）
161F 4℃冰箱（美菱公司）
SANYO 医用低温冰箱（-30℃）（Sanyo公司）
8525超低温冰箱（-70℃）（Forma Scientific公司）
3-18K高速低温离心机（Sigma公司）
TGL-16G台式高速离心机（上海安亭科学仪器厂）
PB-20 pH计（Sartovius公司）
F-4500荧光分光光度计（Hitachi公司）
ELX800uv酶标仪（BIO-TEK公司）
SPD-10AGX液相色谱仪系统（包括LC-10ADvp输液泵、CTO-10AS柱温箱、SPD-10A紫外检测器，Shimadzu公司）
HITACHI L2100GX液相色谱仪系统（包括L2100四元梯度泵、L2200自动进样器、L2300荧光检测器，Hitachi公司）
N2000色谱工作站（浙江大学智达信息工程有限公司）
DKZ-450B型电热恒温振荡水槽（上海森信实验仪器有限公司）
722s可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）
DY89-II型电动玻璃匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司）
UPH-IV-10T型超纯水机（上海优普实业有限公司）
1.3 药品与试剂
DDPH（纯度≥99.5%，ZG药科大学提供）；Tris-base为Roche公司产品；氧化型辅酶Ⅱ（NADP），葡萄糖6-磷酸脱氢酶，6-磷酸葡萄糖二钠，红霉素（Erythromycin），甲氧基异恶唑（Methoxyresorufin），乙氧基异恶唑（Ethoxyresorufin），戊氧基异恶唑（Pentoxyresorufin），异恶唑（Resorufin），甲苯磺丁脲，4-羟基甲苯磺丁脲，对羟基联苯（p-Pheylpohenol），还原型谷胱甘肽（GSH），UDPGA，β萘黄酮均为Sigma-Aldrich公司产品；BCA蛋白定量试剂盒为Pierice公司产品；地塞米松磷酸钠注射液（5 mg•mL-1），江苏涟水制药有限公司生产；注射用苯钠（0.1 g），上海新亚有限公司生产；盐酸苯胺，4-氨基酚，氢溴酸右美沙芬，O-去甲基右美沙芬，普萘洛尔，1-氯2，4-二硝基苯（CDNB），硫酸奎宁，苯酚，硫酸锌，三氯醋酸，高氯酸，氯仿，甲醛，乙酰丙酮，乙腈，甲醇，醋酸等及其他无机和有机试剂均为国产分析纯。
2 方法
2.1 动物分组及给药
将实验大鼠随机分成以下组，每组6～8只。
分组情况 所给药物及组别 给药剂量 给YF式 给药时间
药物组 DDPH（低剂量组） 12.5 mg/kg/d ig，bid 连续7 d
DDPH（中剂量组） 25 mg/kg/d ig，bid 连续7 d
DDPH（高剂量组） 50 mg/kg/d ig，bid 连续7 d
对照组 0.5%羧甲基纤维素钠 10.0 mL/kg/d ig，bid 连续7 d
地塞米松组 地塞米松磷酸钠注射液
（CYP3A阳性对照组） 75 mg/kg/d ip 连续4 d
苯组 注射用苯钠
（CYP2B阳性对照组） 80 mg/kg/d ip 连续3 d
β萘黄酮组 β萘黄酮
（CYP1A1/2阳性对照组） 80 mg/kg/d ip 连续3 d
乙醇组 25%乙醇
（CYP2E1阳性对照组） 10 mL/kg/d ig 连续7 d

2.2 肝微粒体的制备
采用钙沉淀法制备肝微粒体[27]。
各处理组大鼠末次给药后，禁食不禁水，24 h后断头处死。迅速打开腹腔和胸腔，作门静脉插管，剪断下腔静脉，用注射器吸取预冷的生理盐水自门静脉冲洗肝脏至土黄色。将肝脏剪切至适量大小组织块，用滤纸吸干表面水分，称重。按1∶4（W/V）比例加入匀浆缓冲液（50 mmol•L-1 Tris-1.15% KCl，pH＝7.4）匀浆后于4℃下12 000 g离心20 min。取上清液，按10∶1（V/V）比例加入相应量的88 mmol•L-1 CaCl2，混匀，冰浴5 min。4℃下，27 000 g离心15 min，得粉色半透明沉淀，即为肝脏微粒体。沉淀冲洗一次，重悬浮于0.25 mol•L-1蔗糖溶液中，分装，于-70℃储存待测。
2.3 肝微粒体蛋白含量测定
蛋白含量测定采用BCA法，用牛血清白蛋白作为标准，参照试剂盒说明书操作。
（1）取试剂A与试剂B，按A∶B=50∶1（V/V）比例，充分混匀，得BCA工作液。
（2）取BSA蛋白标准品用超纯水稀释得到2，1.5，1，0.75，0.5，0.25 mg•mL-1系列标准浓度溶液。
（3）取适量蛋白标准溶液或待测样品，按1∶20（V/V）加入工作液，充分混合。
（4）37℃温孵30 min，冷却至室温，转移至96孔板，ELX800uv酶标仪测定540 nm处吸光度值。
（5）按所得蛋白标准曲线计算肝微粒体样品混悬液蛋白浓度。
2.4 细胞色素P450酶学分析
2.4.1 CYP450总酶含量测定
采用Omura和Sato的方法[28]测定CYP450总酶含量。
（1）取待测样品用缓冲液稀释得0.3～1 mg•mL-1的蛋白混悬液。
（2）加入连二亚硫酸钠2～3 mg，轻轻混匀。
（3）将样品等量分装入两个比色杯中，样品杯通入CO气体约30 s，以气泡连续，液体不溢出为好。
（4）将比色杯置于722s可见分光光度计中，以参照杯作为空白调零，测定样品杯在450 nm和490 nm处吸光度值（分别为A450和A490）。按以下公式计算CYP450总酶含量：

2.4.2 乙氧基异恶唑O-脱乙基酶（Ethoxyresorufin O-deethylase，EROD），甲氧基异恶唑O-脱甲基酶（Methoxyresorufin O-demethylase， MROD）及戊氧基异恶唑O-脱烷基酶（Pentoxyresorufin O-dealkylase， PROD）活性测定
EROD，MROD及PROD活性根据荧光法以Resorufin为标准品，在荧光分光光度计上测定[29]。
基本原理：

Resorufin在激发波长为530 nm，发射波长为585 nm时有Z大荧光吸收峰。
（1）试剂配制：1 mmol•L-1 Methorxyresorufin；1 mmol•L-1 Ethorxyresorufin；1 mmol•L-1 Pentoxyresorufin（均溶于DMSO）；50 mmol•L-1 Tris-25 mmol•L-1 MgCl2，pH＝7.4；10 μmol•L-1 Resorufin。
（2）取2.5 mg•mL-1微粒体蛋白60 μL，加入1 mmol•L-1的底物6 μL，Tris-MgCl2缓冲液加至570 μL，Z后加入NAPDH生成体系30 μL，在37℃水浴振摇孵育5 min。
（3）加入1 mL甲醇终止反应，于3 000 g下离心10 min。
（4）取上清液置荧光分光光度计于激发波长为530 nm，发射波长为585 nm下测定其荧光强度值。由Resorufin标准曲线，按以下公式计算MROD、EROD、PROD酶活性：
标记一
2.4.3 甲苯磺丁脲羟基酶（Tolbutamide hydroxylase，Tol-hydroxylase）活性测定
Tol-hydroxylase 活性采用反相GX液相紫外检测法测定[30]。
（1）试剂配制：3 mmol•L-1甲苯磺丁脲；10 mmol•L-1 4-羟基甲苯磺丁脲；1 mmol•L-1 DDPH（溶于乙腈）；0.1 mol•L-1磷酸钾缓冲液，pH＝7.4；10 mmol•L-1醋酸钠缓冲液。
（2）取5 mg•mL-1微粒体蛋白50 μL，加入3 mmol•L-1甲苯磺丁脲10 μL，0.1 mol•L-1磷酸钾缓冲液120 μL，蒸馏水10 μL，Z后加入NAPDH生成体系20 μL，在37℃水浴振摇孵育30 min。
（3）加入含有1 mmol•L-1 DDPH的乙腈溶液200 μL终止反应。
（4）涡漩2 min，15 000 g离心5 min。
（5）取上清液20 μL进入HPLC系统测试分析。
（6）HPLC分析条件：Nucleodur C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈/10 mmol•L-1醋酸钠缓冲液（37/63，V/V）；流速：1 mL•min-1；检测波长：230 nm。
（7）由4-羟基甲苯磺丁脲的标准曲线，按以下公式计算酶活性：

标记一2.4.3 右美沙芬O-脱甲基酶（Dextromethorphan O-demethylase，DXM O-demethylase）活性测定
DXM O-demethylase活性采用反相GX液相荧光检测法测定[31]。
（1）试剂配制：100 μmol•L-1右美沙芬；4 μmol•L-1 O-去甲基右美沙芬；1.5 mg•L-1普萘洛尔（溶于乙腈）；0.1 mol•L-1磷酸钾缓冲液，pH＝7.4；0.2% HAC（三乙胺调pH＝4.0）。
（2）取5 mg•mL-1微粒体蛋白20 μL，加入100 μmol•L-1右美沙芬25 μL，0.1 mol•L-1磷酸钾缓冲液125 μL，蒸馏水30 μL，Z后加入NAPDH生成体系50 μL，在37℃水浴振摇孵育30 min。
（3）加入含有1.5 mg•L-1普萘洛尔的乙腈溶液250 μL终止反应。
（4）涡漩2 min，15 000 g离心5 min。
（5）取上清液20 μL进入HPLC系统测试分析。
（6）HPLC分析条件：Nucleodur C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈/甲醇/0.2%HAC（pH＝4.0）（50/40/125，V/V/V）；流速：1 mL•min-1；荧光检测波长：Ex=270 nm，Em=310 nm。
（7）由O-去甲基右美沙芬的标准曲线，按以下公式计算酶活性：

2.4.4 苯胺羟化酶（Aniline Hydroxylase，ANH）的活性测定
采用4-氨基酚形成法测定[32]。
（1）试剂配制：0.1 mol•L-1盐酸苯胺；0.1 mol•L-1 Tris-0.3 mmol•L-1 KCl-20 mmol•L-1 MgCl2，pH＝7.4；50%三氯醋酸；5%三氯醋酸；5%苯酚（含2% NaOH）；1 mol•L-1 NaCO3；10 μmol•L-1 4-氨基酚。
加样一览表：
缓冲液 蒸馏水 微粒体 盐酸苯胺 NAPDH
空白管 325 μL 25 μL 100 μL --- 50 μL
样品管 325 μL --- 100 μL 25 μL 50 μL

（2）按上表加样，依次放入37℃水浴中振摇孵育30 min。
（3）加入预冷的50%三氯醋酸100 μL终止反应。
（4）3 000 g离心15 min。
（5）取上清液350 μL加入5%苯酚50 μL混匀。
（6）加入1 mol•L-1 Na2CO3 100 μL混匀，于37℃水浴振摇孵育30 min，放置至室温，置ELX800uv酶标仪中测定630 nm处光密度值。
（7）由4-氨基酚标准曲线，按以下公式计算酶活性：

2.4.5 红霉素N-脱甲基酶（Erythromycin N-demethylase，ERD）活性测定
采用Nash试剂-甲醛形成法测定[32]。
（1）试剂配制：50 mmol•L-1 Tris-1.15% KCl，pH=7.4；25% ZnSO4；饱和Ba(OH)2；NADPH生成体系（含4 mmol•L-1 NADP，10 mmol•L-1 葡萄糖6-磷酸二钠，葡萄糖6-磷酸脱氢酶4 U•mL-1）；4 mmol•L-1红霉素；3.33 mmol•L-1甲醛标准液；Nash试剂（取醋酸氨5 g，乙酰丙酮100 μL，3%醋酸6 mL，混匀）。
（2）按加样一览表加样后（未加NADPH生成体系），依次放入37℃水浴中温孵约1 min。
（3）预孵后依次加入NADPH生成体系启动反应，37℃水浴振摇孵育20 min（标准管在加入NADPH生成体系后10 min时加入3.33 mmol•L-1甲醛标准液）。
加样一览表：
缓冲液 蒸馏水 微粒体 红霉素 NAPDH 甲醛标准品
空白管 250 μL 75 μL 100 μL --- 75 μL ---
标准管 250 μL 65 μL 100 μL --- 75 μL 10 μL
样品管 250 μL 75 μL 100 μL 50 μL 75 μL ---

（4）孵育结束后，依次加入25% ZnSO4 50 μL立即混匀后，终止反应，然后每管加入饱和Ba(OH)2 50 μL，混匀。
（5）样品于3 000 g下离心10 min。
（6）取上清液350 μL，加入150 μL Nash试剂，混匀后于50℃水浴振摇孵育30 min。孵育结束后，室温冷却，转移至96孔板，ELX800uv酶标仪测定其在420 nm处的光密度值。按以下公式计算酶活性：

2.5 Ⅱ相代谢酶活性分析
2.5.1 谷胱甘肽硫转移酶（Glutathion S-transferase，GST）活性测定
参照文献[33]方法测定。
试剂配制：50 mmol•L-1还原型谷胱甘肽；50 mmol•L-1 CDNB（溶于DMSO）；0.1 mol•L-1磷酸钾缓冲液，pH=6.5。
加样一览表：
空白对照 样品
0.1 mol•L-1磷酸钾缓冲液（pH=6.5） 960 μL 950 μL
50 mmol•L-1还原型谷胱甘肽 20 μL 20 μL
50 mmol•L-1 CDNB 20 μL 20 μL
微粒体样品 --- 10 μL

（2）按上表加样，Z后加入微粒体蛋白后迅速混匀，于340 nm处记录单位时间光密度的变化。按下列公式计算GST含量：

2.5.2 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（Uridine Diphosphate Glucuronosyltransferase UGT）活性测定
参照文献方法测定[32]。
（1）反应液中含微粒体蛋白0.25 mg，0.25% TritonX-100 10 μL，50 mmol•L-1 MgCl2 25 μL，5 mmol•L-1对羟基联苯25 μL（溶于DMSO），1 mmol•L-1 Tris-HCl（pH7.4）25 μL，用双蒸水补足至250 μL。空白管不加微粒体，用双蒸水补足。
（2）反应液在37℃水浴温孵5 min后加入30 mmol•L-1 UDPGA 50 μL启动反应，继续温孵10 min。
（3）孵育结束后将样品置冰浴上，加入10%过氯酸250 μL，氯仿1 mL终止反应。
（4）振摇10 min，3 000 g离心5 min，取水相250 μL，加1.6 mol•L-1甘氨酸缓冲液（pH=10.3）1.75 mL，于激发波长290 nm，发射波长325 nm处测定荧光强度F，以硫酸奎宁作相对标准计算酶活性，按下列公式计算酶活性：

（5）硫酸奎宁标准曲线的制备：
取干净的EP管，向管中分别加入100 mg•L-1奎宁100 μL，200 μL，400 μL，800 μL，再分别加入0.05 mol•L-1硫酸，使总体积为4 mL。混匀后在激发波长350 nm，发射波长450 nm处测定样品中的荧光强度，求出标准曲线的k值。
3 数据的处理和分析
数据以均数±标准差（±s）表示，采用SPSS 11.5统计软件对数据进行统计学分析。