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如何去除质粒提取中的RNA杂质质粒DNA琼脂

hanyes475 2017-10-08
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baby墨情86
现在质粒提取无论手提还是试剂盒,其根本原理大多还是碱裂解法:当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时,蛋白质与DNA发生变性,当加入中和液后,质粒DNA分子能够迅速复性,呈溶解状态,离心时留在上清中;蛋白质与染色体DNA不变性 而呈絮状,离心时可沉淀下来。进一步的质粒DNA获取,手提是经过苯酚、氯仿抽提,RNA酶消化和乙醇沉淀 等简单步骤去除残余蛋白质和RNA以及过多的盐分,而试剂盒则在此基础上使用DNA吸附柱来吸附质粒DNA,在洗脱得到质粒。评价:1,可通过琼脂糖电泳来检查所获质粒的大小(准确大小需酶切),有无细菌基因组DNA和RNA污染,以及质粒的断裂多少,同时也可根据marke量对样品进行大致的浓度定量;2,通过紫外分光光度计测定样品OD280和OD260,计算其比值来衡量样品的纯度。经验值:纯DNA:OD260/OD280≈1.8(>1.9,表明有RNA污染;<1。6,表明有蛋白质、酚等污染)。同时,用紫外分光光度计对其进行精确浓度定量。去除蛋白质:如上所言,提取质粒过程中,一部分蛋白质会在碱裂解法中形成沉淀,得以去除;还有更多不能形成沉淀的蛋白质在用酚/氯仿/异戊醇进行抽提的过程中被去除。若有疑问,欢迎继续讨论,祝愉快!
20 0 2017-10-09 0条评论 回复
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