植物染色体DNA的抽取及浓度测定

　　植物组织中绝大部分是核DNA，它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白（即染色质或染色体）的形式存在于细胞核内。十六烷基三甲基溴化铵是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中可溶，当降低溶液盐浓度到一定程度时，从溶液中沉淀。
　　浓度的测定，需测定在230、260和280nm处的消光值，经验数据表明，纯净的核酸溶液A260/A230的消光值比大于或等于2.0；A260/A280大于或等于1.80。A260/A280值过小，说明蛋白未脱净；A260/A230过小，说明有杂质（一般为多酚类或色素）。

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植物基因组提取及DNA的浓度测定
一、实验目的
1、 掌握用CTAB法提取植物总DNA的方法和基本原理。 2、 学习利用紫外分光光度计法测定DNA溶液的浓度。
二、实验原理
1、2%CTAB抽提缓冲液在65摄氏度水浴中预热，与此同时，用剪刀、镊子取8片约0.2g的子叶于研钵中，放在冰水研至匀浆状。
2、用移液器向研钵中加入700微升2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅拌。然后将研磨液倒入1.5ml的灭菌离心管中，再置于65摄氏度的恒温水浴锅中，每隔10min轻轻摇动，40min后取出。
3、冷却2min后，用移液器吸700微升的氯仿/异戊醇到离心管中，剧烈振荡2~3min，使两者混合均匀。
4、与另一组同学的离心管平衡，对称放入离心机中，10000r/min离心10min，与此同时，将60微升的预冷的异丙醇加入另一个新的灭菌离心管中。
5、移液器轻轻地吸取上清液（约600微升），转入含有异戊醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30s，使异丙醇与水层充分混合至能看到DNA絮状物。
6、同样，与另一组同学的离心管平衡，对称放入离心机中，10000r/min离心1min，然后立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出。
7、将离心管倒立于滤纸上1min，直立离心管，加入720微升的75%的预冷的乙醇及80微升5mol/L的乙醇钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中。放置10min，使DNA块状物的不纯物溶解。
8、与另一组同学的平衡，对称放入离心机，10000r/min离心1min，倒掉液体，再加入800微升75%乙醇，将DNA再洗2min。
9、与另一组同学的平衡，对称放入离心机，10000r/min离心30s，立即倒掉液体，将离心管倒立于滤纸上，数分钟后，直立离心管，干燥DNA。
10、加入50微升0.5XTE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37摄氏度恒温箱中约1.5h，消化RNA。
11、取2.99ml蒸馏水至一干净的试管，再加入上述DNA溶液10微升，混匀。 12、先3ml蒸馏水至比色杯，进行紫外光空白测定，比较两杯差异，然后倒掉其中一杯蒸馏水，加入3ml已稀释的DNA溶液，测定260nm及280nm的光吸收值
注意事项：
1、 镊子、剪刀、研钵、子叶都得用酒精消毒。 2、 叶片磨得越细越好。 3、 移液器使用时，要注意量程，枪头加同一液体且没被溶液污染时，可重复使用，
加入不同液体或被溶液污染时，要换枪头。
4、 吸取含DNA时要用剪短的枪头，减少机械切割力对DNA的破坏。
5、 移液器使用时要始终保持竖直，或稍微倾斜，不可平拿，甚至倒过来，防止液
体进入移液器中，污染移液器。 6、 紫外分光光度计要预热。
7、 紫外分光光度计打开盖，使指示灯指向T，使透光率为0，盖上盖，使透光率
为，然后使指示灯指向A，进行测量。 8、 要比较两杯的差异，提高结果的准确性。

四、实验结果

A260 A280 装溶液的比色杯与另一个比色杯的差值 0.005 0.004 溶液
0.118 0.054 溶液的Z终值
0.113
0.05
A260/A280=0.113/0.050=2.26 dsDNA=50*(A260)*稀释倍数 =50*0.113*300 =1695微克/ml 分析：
1、 采用机械研磨的方法，可破坏植物的组织和细胞，为了防止匀浆中各种酶类（尤其
是氧化酶类），抽提缓冲液中的B-巯基乙醇可降低这些酶类的活性，同时，在冰上研磨，有两方面的作用：（1）、降低酶的活性，（2）、使细胞中水结晶，细胞膨胀，利于材料的破碎。
2、 CTAN表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以
游离出来。
3、 抽提缓冲液中的EDTA为金属螯合剂，能除去匀浆液中的Mg2+和Mn2+，YZDNA
酶的活性。
4、 抽提缓冲液中的Nacl浓度很高，DNP易溶于高盐溶液，RNP在高盐溶液中溶解度
不大，以分离DNP和RNP。 5、 氯仿能使蛋白质变性，同时有吸收匀浆液中色素的作用。异戊醇防止液相之间起泡，
利于液相分离。这样DNA溶于上层CTAB抽提液中，细胞碎片在下层，变性蛋白质在中间。
6、 第2步的轻轻振荡，是为了防止DNA受破坏，第3步的剧烈振荡是为了DNP中蛋
白质与DNA的分离。
7、 异戊醇一方面：除去CTAB，因为CTAB易溶于异丙醇，另一方面：沉淀DNA。 8、 离心后那可除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入预冷的乙醇使DNA沉淀，
因为DNA难溶于乙醇冷的乙醇效果更佳。 9、 Z后的TE缓冲液中含RNA酶，消化RNA。 10、 抽提缓冲液中Tris-Hcl使DNA保持天然的完整状态。 11、 DNA的吸收光谱峰在260nm处，据计算，测定此波长下DNA溶液的A值，
当A260=1时，双链DNA含量约为50微克/ml，据此可用紫外分光光度计测定溶液中DNA含量。由于蛋白质的吸收峰在280nm处。如果A260/A280在1.8-2.0时，认为以达到较高的纯度，如低于此值其中蛋白质较多，如高于此值说明其中含RNA或DNA片段过多。 12、 本实验A260/A280=2.26>2.0，很可能是DNA片段过多，因为本实验第5步没
用剪短的枪头。 13、 比较两比色杯的差异，是因为比色杯可能不标准，会产生小的误差，通过记录
两者的差异，然后通过结果相减可消除这种差异造成的影响。 14、 DNA溶液的浓度可用dsDNA=50*(A260)*稀释倍数来算。