产油真菌的诱变育种

紫外诱变和微波诱变是较常用的物理诱变方法，
它们操作简单，对设备要求不高，不需要昂贵的设备，
比较适合基层单位进行诱变育种。本文就这两种方法
对不同多不饱和脂肪酸诱变效果进行比较研究，为采
用这两种方法进行产油菌株诱变育种提供一些依据
1 试验材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 菌株
本实验室分离并保存。
FR3，刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)；
AGEDm59、AGEDm 95为菌株AGED激光诱变
株，多形单毛孢(Monoblepharispolymorpha Comu)。
其中FR37-~][麻酸含量、AGEDm59花生四稀酸含
量、AGEDm 95二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸含量
较高。
1．1．2 实验仪器
超净工作台、格兰氏微波炉、索氏抽提器、粉碎机、电子天平；
气相色谱仪：福立9790气相色谱仪，CT-IA氮、
氢、空气发生器(武汉科林分析技术研究所)，GPI一2
气体净化器(福立仪器)。
1．1．3 试验试剂
、石油醚、苯、甲醇、氢氧化钾；
GLA 甲脂、AA甲脂、EPA甲脂及DHA 甲脂标准
品购白Sigma公司，其他试剂均为分析纯。
1．1．4 培养基
斜面培养基为PDA 培养基；种子和发酵培养基
为PDY液体培养基。
1．2 试验方法
1．2．1 孢子悬液的制备
FR3取7天种龄、AGEDm59、AGEDm 95取l0
天种龄的斜面菌株，用无菌水洗下孢子(并用接种针轻
刮表面)，FR3配成10一、AGEDm59、AGEDm 95配
成l0。浓度的孢子液。
1．2．2 诱变及保种
紫外诱变：先打开紫外灯照射30min，取0．5ml孢
子悬液到倒好DPA固体培养基的平皿中，涂布均匀，
放在紫外灯下(紫外灯为25W，照射距离为35cm)
照射，之后置于25℃避光24h培养。随机挑取单菌落
于斜面中保存。
微波诱变：由于微波照射会产生热效应，因此在进
行微波诱变时采用了间歇性照射【6】，即先照射一段时
间后进行冷却，再照射，照射时间为各次照射时间的
累加。250mi三角瓶装100ml经过活化的孢子悬液(即
先在150r／min的摇床上振荡5h)【7】，用中等强度功率
照射，每次照射的时间为l0秒，随机挑取的诱变株都
保存于斜面中。
1．2．3 菌丝培养和收获
把长好的诱变株从斜面转到500ml三角瓶中(内
装200mlPDY液体培养基)，置于25℃ 中l50转／分钟
摇床上培养。FR3培养4天，AGEDm59、AGEDm 95
培养6天后下样，用滤布过滤获得湿菌丝体。将所得
湿菌丝体在36℃烘箱内烘干，称重，计算生物量；
1．2．4 油脂提取及甲脂化
将干菌体粉碎，并用脱脂滤纸包好，用100ml乙
醚在43~C进行索氏提取6h，回收溶剂，用N2吹走残
留溶剂称重，计算粗油脂量。油脂甲脂化的方法见参考
文献
1．2．5 气相色谱分析条件
色谱柱：FFAP交联石英毛细管柱(0．25mmx 0．25
pmx30m)；检测器：氢火焰检测器(FID)；载气：N2(流量60 mLlmin)：温度：进样器温度160℃ ，检测器温
度240℃；柱温：160℃升至200℃ (8℃／rnin)，继续升
至220℃ (2℃／min)，恒温7min，降至160℃ 。
1．2．6 多不饱和脂肪酸含量分析
用微量进样器吸取l 上层清液进样分析，对照
标准品保留时间进行定性，由面积归一化法确定相对
百分含量。
2 结果与分析
紫外诱变中不同致死率对诱变的效果影响较大，
据报道，在致死率为75～80％之间诱变的效果Z好I9J，
3株菌株从致死率为75～80％的照射剂量中共获得105
株紫外诱变株，其中F 为2l株，AGEDm59为58
株， AGEDm95为26株。
微波诱变中致死率对诱变效果的影响不同的研究
有不同的结果，本实验采用的致死率为40~60％【l0】，
从3株菌中共获得78株微波诱变株，其中FR3为27
株，AGEDm59为25株， AGEDm95为26株。
2．1 生物量
从表l的生物量看，AGED系列2株菌紫外诱变
的正诱变率远高于微波诱变，对菌株FR3而言微波诱
变正诱变率略高于紫外诱变。从生物量的平均提高率
和Z大提高率上也得到同样的结果，但提高的幅度不
大，只有菌株FR3微波诱变的Z大提高率和AGEDm59
紫外诱变的Z大提高率超过10％，分别达到10．29％
和l3．87％ 。
从结果分析来看，两种诱变方法均不能大幅度提
高生物量。
2．2 油脂产量
从表2可看出，在油脂产量正诱变率、平均提高
率和Z大提高率上微波诱变比紫外诱变有显著提高。
除了AGEDm59两种诱变效果比较接近外，其它的两
株菌的平均提高率和Z大提高率微波诱变比紫外诱变
几乎提高2倍以上，而且微波诱变的Z大提高率比较
稳定，都在20％左右。
从结果分析来看，采用微波诱变来提高油脂产量
可以取得较好的效果。