关于支原体计数

【定义】
支原体（mycoplasma）：又称霉形体，为目前发现的Z小的Z简单的细胞，也是唯yi一种没有细胞壁的原核细胞。支原体细胞中唯yi可见的细胞器是核糖体。

【发现】
支原体是在1898年发现的，是一种简单的原核细胞。其大小介于细菌和病毒之间。结构也比较简单，多数成球形，没有细胞壁，只有三层结构的细胞膜，故具有较大的可变性。支原体可以在特殊的培养基上接种生长，用此法配合临床进行诊断。与泌尿生殖道感染有关的主要是分解尿素支原体和人型支原体两种，约有20－30％的非淋菌性尿道炎的病人，是由以上两种支原体引起的，是非淋菌性尿道炎及宫颈炎的第二大致病菌。在成年人的泌尿生殖道中分解尿素支原体和人型支原体感染率主要与性活动有关，也就是说，与次数的多少、对象的数量有关，不管男女两性都是如此。据统计女性的支原体感染率更高些，说明女性的生殖道比男性生殖道更易生长支原体。另外，分解尿素支原体的感染率要比人型支原体的感染率为高。

【性状】
·形态与结构

支原体的大小为0.2～0.3um，可通过滤菌器，常给细胞培养工作带来污染的麻烦。无细胞壁，不能维持固定的形态而呈现多形性。革兰氏染色不易着色，故常用Giemsa染色法将其染成淡紫色。细胞膜中胆固醇含量较多，约占36%，对保持细胞膜的完整性具有一定作用。凡能作用于胆固醇的物质（如二性霉素B、皂素等）均可引起支原体膜的破坏而使支原体死亡。

支原体基因组为一环状以双链DNA，分子量小（仅有大肠杆菌的五分之一），合成与代谢很有限。

肺炎支原体的一端有一种特殊的末端结构（terminal structure），能使支原体粘附于呼吸道粘膜上皮细胞表面，与致病性有关。

·培养特性

营养要求比一般细菌高，除基础营养物质外还需加入10～20%人或动物血清以提供支原体所需的胆固醇。Z适pH7.8～8.0之间，低于7.0则死亡，但解脲脲原体Z适pH6.0～6.5。

大多数兼性厌氧，有些菌株在初分离时加入5%CO2生长更好。生长缓慢，在琼脂含量较少的固体培养基上孵育2～3天出现典型的“荷包蛋样”菌落：圆形（直径10～16um），核心部分较厚，向下长入培养基，周边为一层薄的透明颗粒区。此外，支原体还能在鸡胚绒毛尿囊膜或培养细胞中生长。

繁殖方式多样，主要为二分裂繁殖，还有断裂、分枝、出芽等方式，盖因缺乏细胞壁造成分裂时二个子细胞大小均所致。同时，支原体分裂和其DNA复制不同步，可形成多核长丝体。

·生化反应与分型

一般能分解葡萄糖的支原体则不能利用精氨酸，能利用精氨酸的则不能分解葡萄糖，据此可将支原体分为两类（见表19- 1）。解脲脲原体不能利用葡萄糖或精氨酸，但可利用尿素作能源。

各种支原体都有特异的表面抗原结构，很少有交叉反应，具有型特异性。应用生长YZ试验（Growth inhibition test，GIT）、代谢YZ试验(Metabolic inhibition test，MIT)等可鉴定支原抗原，进行分型。

表19-1 人类支原体的主要生物学性状 名称 需要胆固醇 分解葡萄糖 分 解 还原四氮唑 吸附红细胞

支原体属

人型支原体

唾液支原体

发酵支原体

肺炎支原体

口腔支原体

生殖支原体

脲原体属

解脲脲原体 +++++++ --++-+- ++--+-- ------+ ---+-±- ---++-+

·抵抗力

支原体对热的抵抗力与细菌相似。对环境渗透压敏感，渗透压的突变可致细胞破裂。对重金属盐、石炭酸、来苏尔和一些表面活性剂较细菌敏感，但对、结晶紫和亚锑酸盐的抵抗力比细菌大。对影响壁合成的抗生素如青霉素不敏感，但红霉素、四环素、链霉素及氯霉素等作用于支原体核蛋白体的抗生素，可YZ或影响蛋白质合成，有杀灭支原体的作用。

·致病性与免疫性

支原体不侵入机体组织与血液，而是在呼吸道或泌尿生殖道上皮细胞粘附并定居后，通过不同机制引起细胞损伤，如获取细胞膜上的脂质与胆固醇造成膜的损伤，释放神经（外）毒素、磷酸酶及过氧化氢等。

巨噬细胞、lgG 及 lgM 对支原体均有一定的杀伤作用。呼吸道粘膜产生的SlgA抗体已证明有阻止支原体吸附的作用。在儿童中，致敏淋巴细胞可增强机体对肺炎支原体的抵抗力。

【感染】

致病支原体中，肺炎支原体起肺炎，人型支原体、解脲支原体和生殖器支原体主要泌尿生殖道感染。支原体肺炎又称原发性非典型肺炎，支原体肺炎全年均可发病，以冬季多见，可有小流行。支原体脑炎是学龄前儿童及青年人常见的一种肺炎，支原体肺炎主要通过飞沫传播，潜伏期较长，可达2～3周。支原体肺炎虽然病程较长，肺部病变较重，炎症吸收较慢，但绝大多数预后都是良好的，合并症亦少。生殖器支原体感染是近年新明确的一种性接触传播疾病。成人主要通过性接触传播，新生儿则由母亲生殖道分娩时感染。成人男性的感染部位在尿道粘膜，女性感染部位在宫颈。新生儿主要引起结膜炎和肺炎。

【诊断】

支原体实验室检测方法有：形态学检查、支原体培养、抗原检测、血清学方法和分子生物学方法。

解脲支原体MB抗原的研究表明：MB抗原是解脲支原体感染时被识别的主要外膜抗原，具有种特异性，包含血清特异的和交叉反应的抗原决定簇。编码MB抗原的基因长1200多个碱基、N端1/3为保守区，包含群特异的抗原决定簇：C端2/3是由重复序列组成的可变区，包含型特异的抗原决定簇，对该抗原的研究及对于研究疾病的发病机制和免疫机制起重要作用。MB抗原位于解脲支原体膜的表面，N端固定于膜上使C端重复区暴露于微生物周围的微环境。N端可以作为其分群分型的基础，C端Z可能首先与宿主的防御系统相遇而引起主要的抗体反应，是理解它的发病机制和免疫机制的基础。MB抗原与疾病的关系，以及它在疾病中的作用还有待进一步探讨。

测定支原体抗体的血清学试验方法中，有支原体特异性血清学检测和非特异性血清学检测：支原体特异性血清学检测方法中，Z常用的是补体结合试验，另有间接免疫荧光染色检查法、生长YZ试验、代谢YZ试验、间接血凝试验、酶免疫法和酶联免疫吸附试验（ELISA）等。支原体的非特异血清学方法有肺炎支原体冷凝集试验与MG链球菌凝集试验，对支原体肺炎能起辅助诊断的作用。检测特异性抗体IgG的方法尚不能达到早期快速诊断的目的，抗原的检测为今后研究的发展方向。目前已有用酶联免疫吸附试验、荧光标记抗体、肺炎支原体膜蛋白单克隆抗体和反向间接血凝法直接检测分泌物和体液中支原体抗原的报道，具有很高的特异度和灵敏度。人体感染肺炎支原体后，能产生特异性IgM和IgG类抗体。IgM类抗体出现早，一般在感染后1周出现，3～4周达高峰，以后逐渐降低。由于肺炎支原体感染的潜伏期为2～3周，当患者出现症状而就诊时，IgM抗体已达到相当高的水平，因此IgM抗体阳性可作为急性期感染的诊断指标。如IgM抗体阴性，则不能否定肺炎支原体感染， 需检测IgG抗体。IgG较IgM出现晚，需动态观察，如显著升高提示近期感染，显著降低说明处于感染后期。由此提示IgG与IgM同时测定，可提高诊断率，达到指导用药、提高LX之目的。Savyon公司提供支原体IgM、IgG和IgA抗体ELISA检测试剂盒。

支原体分子生物学检测方法有基因探针和聚合酶链反应（PCR）等方法。基因探针的核酸杂交法，虽然敏感性和特异性都很高，但基因探针常用同位素标记，放射性危害大，设备要求高且繁琐难以推广，近年来发展的PCR技术，使得支原体检测变得简便、快速、敏感、特异，为支原体的检测和实验研究开辟了一个广阔的前景。

tu1血清标本中的MP抗体与板上包被的MP抗原结合

tu2抗人IgG／IgM/IgA-HRP和板上的抗原抗体复合物结合

tu3加入的底物被酶分解的产物的颜色深度与标本中抗体的浓度成正比

SeroMP支原体ELISA试剂盒

本试剂盒是检测支原体肺炎的第三代产品，它通过ELISA法在酶标板上完成人血清的IgM、IgG和IgA抗体检测。沙眼衣原体感染的诊断方法有细胞培养、直接抗原检测、分子生物学和血清学方法。直接抗原检测法中获取标本（在感染部位取材）较困难，所得结果可靠性也不强。而本试剂盒采用的血清学检测以血清为标本，可检测各个部位和各个时期的肺炎衣原体感染，并且某一类型的抗体象征疾病处于一定发展阶段。

【培养】
细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。国内外研究表明，95％以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和莱氏无胆甾原体（A.laidlawii），为牛源性。以上是Z常见的污染细胞培养的支原体菌群，但能够污染细胞的支原体种类是很多的，国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。

支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（一些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。

组织细胞培养工作中，主要从以下几个方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基中加入适量的抗生素。支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用方法有抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。支原体Z突出的结构特征是没有细胞壁，一般来讲，对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如 -内酰胺类、万古霉素等完全不敏感；对多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺药物普遍耐药。对支原体Z有YZ活性及常用于支原体感染ZL的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮；其他类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小YZ作用，所以常不用来作为支原体感染的化学ZL剂。InvivoGen公司研究开发的新一代支原体抗生素M-Plasmocin能有效地杀灭支原体，不影响细胞本身的代谢，并且用M-Plasmocin处理过的培养细胞，不会重新感染支原体。

支原体有时被称为类菌质体。无细胞壁，多呈不规则球状、长丝状，可分枝，营寄生共生或腐生。一般侵害对象为动植物，可造成多种疾病。

支原体（Mycoplasmal）是目前所能发现的能在无生命培基中生长繁殖的Z小的微生物。

支原体体形多样，基本为球形，亦可呈球杆状或丝状，其菌落呈针尖大小，故又称之为微小支原体。支原体特点是无细胞壁及前体，细胞器极少。DNA的G+C含量低，菌体内具有非常小的染色体组，其分子量约为45×108，菌体细胞大小约为0.2-0.3μm，很少超过1.0μm。由三层蛋白质和脂质组成的膜样结构以及一层类似毛发结构组成。支原体由二分裂繁殖，形态多样。支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰氏染色为阴性。支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长。用培养基培养。营养要求比细菌高。由于它没有细胞壁，因此对影响细胞壁合成的抗生素，如青霉素等不敏感，但红霉素、四环素、卡那霉素、链霉素、氯霉素等作用于核蛋白体的抗生素，可YZ或影响支原体的蛋白质合成，有杀伤支原体作用，支原体对热抵抗力差，通常55℃经15分钟处理可使之灭活。石碳酸，来苏儿易将其杀死。在培养基中置入脲素并以硫酸锰作指示剂极易与其他支原体作出鉴别。

它广泛分布于自然界，有80余种。与人类有关的支原体有肺炎支原体（M-pneumonie，Mp）、人型支原体（M.humenis，MH）、解脲支原体（Ureaplasma urealyticum， UU 分解尿素支原体）和生殖器支原体（M.genitalium，MG）等。

肺炎支原体引起肺炎。现已从人类泌尿生殖道分离出来7种支原体，其中分离率较高而与泌尿生殖道疾病有关，是解脲支原体，其次是人型支原体。人型支原体（M.humenis，MH）、解脲支原体（Ureaplasma urealyticum，UU）和生殖器支原体（M.genitalium，MG）都会引起泌尿生殖道感染。

解脲支原体(ureaplasma ure-alyticum)是一种原核微生物，呈球杆状，大小为125-250毫微米，分子量4.5*108，高度多形性，没有坚硬的细胞壁，能在无细菌的培养物中增殖，能产生尿素分解酶分解尿素。特异性抗体能YZ它生长，因其缺乏坚硬的细胞膜，对青霉素耐药，对细胞膜有亲和性，生长繁殖时需要类固醇物质。四环素、红霉素、壮观霉素对之有效。婴儿或无接触的女性生殖道内找不到解脲支原体。而性生活越乱，这种支原体阳性率也越高。Mc Donald 1982年报告587例急性尿道炎症状病人中，209例(36%)中段尿中分离出解脲支原体。

人型支原体(mycoplasma hominis)支原体对外界环境抵抗力弱，45℃15min即可被杀死。对肥皂、酒精、四环素、红霉素敏感。

【机理】
支原体只能粘附在呼吸道或泌尿生殖道的上皮细胞表面的受体上，而不进入组织和血液。支原体引起细胞损害的原因为：粘附于宿主细胞表面的支原体从细胞吸收营养，从细胞膜获得脂质和胆固醇，引起细胞损伤；支原体代谢产生的有毒物质，如溶神经支原体能产生神经毒素，引起细胞膜损伤；脲原体含有尿素酶，可以水解尿素产生大量氨，对细胞有毒害作用。支原体除可以粘附于细胞、巨噬细胞表面外，还可以粘附于精子表面，从而阻止精子运动，其产生神经氨酸酶样物质可干扰精子与卵子的结合。这就是支原体感染引起不育不孕的原因之一。

在动物实验发现，小鼠腹腔巨噬细胞可以杀灭支原体，而中性粒细胞的作用不大。在体外，IgG1和IgG2抗体有调理作用。可加强巨噬细胞对支原体的杀伤作用。

【对比】
L型细菌是在抗生素、溶菌酶等作用下变成的一种细胞壁缺陷型细菌，其许多特性与支原体相似，在鉴定时很有必要将二者区别开来（见下表）。

表19-2 支原体与L型细菌的区别

支原体 L型细菌

自然界中广泛存在绝大多数生长需胆固醇

在遗传上与细菌无关，且无论在什么条件下也不能变成细菌

菌落较小，0.1～0.3mm 自然界很少存在生长不一定需要胆固醇

在遗传上与原菌相关，并可在诱导因素去除后回复为原菌

菌落稍大，0.5～1.0mm

主要病原性支原体

一、肺炎支原体所致

肺炎支原体（M.Pneumonia）是人类支原体肺炎的病原体。支原体肺炎的病理改变以间质性肺炎为主，有时并发支气管肺炎，称为原发性非典型性肺炎。主要经飞沫传染，潜伏期2～3周，发病率以青少年Z高。临床症状较轻，甚至根本无症状，若有也只是头痛、咽痛、发热、咳嗽等一般的呼吸道症状，但也有个别死亡报道。一年四季均可发生，但多在秋冬时节。

肺炎支原体的致病首先通过其顶端结构粘附在宿主细胞表面，并伸出微管插入胞内吸取营养、损伤细胞膜，继而释放出核酸酶、过氧化氢等代谢产生引起细胞的溶解、上皮细胞的肿胀与坏死。诱发机体产生的抗体也可能参与了上述病理损伤。呼吸道分泌的SlgA对再感染有一定防御作用，但不够牢固。

肺炎支原体的诊断方法主要依靠分离培养和血清学试验。标本可采可疑病人的痰或咽试子，接种于含血清或酵母浸膏的琼脂培养基。5～10天后观察有无直径30～100um的圆形房顶样菌落。多次传代后可变为典型的“荷包蛋”样菌落，并能吸附多种动物红细胞和气管上皮细胞、HeLa细胞等，且此类吸附可被特异性抗体所YZ。分离的支原体经形态、溶血与生化反应作初步鉴定后需进一步用特异性抗血清作生长YZ试验和代谢YZ试验。用患者血清与支原体脂质抗原作补体结合试验，恢复期较急性期效价高4倍以上具有诊断价值。亦可用间接免疫荧光试验、间接血凝ELISA检测标本。另外，有1/3～3/4患者的血清可与人O型红细胞在4℃时有非特异性凝集（称为“冷凝集试验”），37℃时消失，患病一周时达到高峰。此方法简便，有助于诊断。

ZL可选用红霉素、四环素和氯霉素等。

支原体死疫苗和减毒活疫苗仍在试验中。

二、解脲脲原体

解脲脲原体（M.urealyticum）为脲原体属中唯yi的一个种，因生长需要尿素而得名。菌落微小，直径仅有15～25um，须在低倍显微镜下观察，故旧称T株 (tiny strain)。菌落表面有粗糙颗粒，在合适条件下可转成典型的荷包蛋样菌落。生长需要胆固醇和尿素，分解尿素为其代谢特征，产生氨氮，使培养基pH上升，导致自身死亡。

解脲脲原体可引起泌尿生殖道感染，并被认为是非淋球菌性尿道炎中仅次于衣原体（占50%）的重要病原体。由于80%孕妇的生殖道内带有解脲脲原体，因此可通过胎盘感染胎儿而导致早产、死胎，或在分娩时感染新生儿，引起呼吸道感染。此外，解脲脲原体还可引起不孕症。

ZL用红霉素、四环素、QL霉素等高度敏感的抗生素。

衣原体支原体对生殖系统的影响

衣原体支原体对生殖系统的影响主要体现为，对男性来说影响产生精子的器官，对女性来说影响输送精子的器官，或者损伤卵子生活的器官。
男性生成精子的器官受到了衣原体支原体的攻击以后，能产生精子的腺体越来越少，所以产生的量也少，另外活力也会受到影响，这样会引起男性的不孕。 对女性来说，子宫内膜有炎症后，卵子不能正常的着床，不能在子宫里待住，就会出现流产、早产，如果引起输卵管的炎症，就会引起堵塞，卵子不能通过，就不能受孕。
衣原体支原体对生殖系统的影响还体现在对性生活质量的影响，例如疼、出血，就会妨碍快乐的程度，可能会导致恐惧感。