提取核酸时，加入蛋白酶后为什么要加热到65摄氏度

提取核酸时，加入蛋白酶后为什么要加热到65摄氏度
请注意：SDS对于脱氧核糖核酸酶以及核糖核酸酶均有YZ作用.
这里提供的是由Marmur于1961年建立，经Dale等人简化和发展，此方法略加修改后可用于其他细菌种类.主要原理是：采用去垢剂破碎细菌细胞，酚－氯仿萃取蛋白，使用核糖核酸酶和蛋白酶K进行进一步的纯化，所提取的DNA无RNA和蛋白质污染，可用于限制性内切酶消化，分子克隆.
⑴材料
①20倍SSC缓冲液：3mol/l NaCl; 0.3mol/l 醋酸钠；pH 7.0(高压灭菌后，4摄氏度保存可长期使用)
②酚/氯仿（1：1）：一般市售的酚需要重蒸处理，市售的酚常含有杂质而呈粉色和淡黄色，需要重蒸二次，收集沸点160℃部分，小瓶分装，瓶内空腔充氮气，－20℃密封保存，以免氧化，用前从冰箱中取出，68℃蒸馏水饱和，加入8—羟基喹啉（100g酚加0.1g），酚变为黄色.8—羟基喹啉是抗氧化剂，并能部分YZ核糖核酸酶，含8—羟基喹啉的酚用等体积1.0mol/L pH 8.0Tris 缓冲液抽提，再用0.1mol/L pH 8.0含0.2％β－巯基乙醇的Tris缓冲液抽提数次，酚溶液的pH应大于7.6.此酚溶液在平衡缓冲液覆盖下4℃可保存一个月，纯化和制备酚溶液都要带手套，以免损伤皮肤.
③核糖核酸酶：无DNA酶污染，将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/LTris－Cl(pH 7.5)15mmol/L Nacl 溶液中，浓度为10mg/ml.于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装后于－20℃保存.
④蛋白酶K
⑤TES缓冲液：10mmol/L Tris-HCl， pH 8.0; 10mmol/L NaCl;1mmol/l EDTA
⑵方法
①取单菌落接种于5mlLB培养液中，37℃振荡培养过夜.（使用试管）
②将上述菌液接种于200mlLB培养液中，37℃振荡培养过夜.（使用500ml或1000ml三角瓶）
③离心，收集沉淀（5000r/m，10分钟）
④将沉淀悬浮于20ml 20倍SSC缓冲液中，混匀.
⑤加入200mg SDS，室温下振荡过夜，使细菌细胞充分裂解，裂解液呈粘稠状
⑥加入等体积的酚/氯仿溶液，温和地混匀，细心地回收上层水相（注意不要触及二相之界面），重复萃取三次
⑦加入2倍体积无水乙醇，此时可见到絮状DNA沉淀或用玻璃棒绕取收集
⑧将DNA溶于15ml 2倍SSC溶液中，加入核糖核酸酶（Z终浓度50ug/ml），37℃保温1小时
⑨加入蛋白酶K（50ug/ml），继续保温1小时
⑩加入等体积苯酚萃取一次，在回收的水相中加入2.5倍体积的无水乙醇，－20℃静止过夜
25000g，4℃，离心15分钟，收集沉淀，用－20℃无水乙醇洗涤一次；将DNA在真空干燥器中抽干，溶于10mlTES缓冲液中，4℃保存备用.