上转换发光纳米粒子为什么无生物背景荧光

       上转换荧光材料是一类在长波长光激发下能产生短波长光的发光材料，基于这个特点，上转换发光材料在生物荧光标记、太阳能电池、红外光电探测、激光及显示等众多领域具有巨大的应用前景。稀土掺杂的上转换发光纳米材料的激发光为红外光，且生物组织的光透过窗口处于红外波段，这意味着能够有实现荧光探针体内发光。另外稀土掺杂的上转换发光纳米材料还具有发光灵敏性高，光稳定性好，化学性质稳定，生物毒性低等优点。因此，稀土掺杂的上转换发光纳米材料有望成为理想的具有应用前景的生物荧光探针。

       NaYF4是目前公认的上转换效率较高的基质材料，通过掺杂铥(Tm3+)、铒(Er3+)或者其他稀土离子作为激活剂，镱(Yb3+)作敏化剂，在980nm红外光的激发下，利用上转换发光过程可实现可见光发射。通过控制纳米材料的尺寸，并利用各种表面修饰剂对纳米粒子的表面进行适当修饰，增强其生物兼容性，从而可以制备红外光激发的生物荧光探针，进而实现生物细胞、组织的荧光检测与标记。

一、上转换荧光光谱
采用北京卓立汉光自主研发生产的OmniFluo“卓谱”荧光光谱测量系统测试NaYF4:Yb/Tm的上转换荧光光谱，激发光源选用980nm固体激光器，荧光光谱图如1所示；图2为Yb3+离子和Tm3+离子的能级跃迁图以及NaYF4:Yb/Tm的上转换发光机制。

图1  NaYF4:Yb/Tm的上转换荧光光谱

图1为NaYF4:Yb/Tm的上转换荧光光谱图，发射峰主要对应于Tm3+：289 nm左右对用于1I6→3H6，354 nm左右对应于1I6→3F4，361.5 nm左右对用于1D2→3H6，450 nm左右对用于1D2→3F4，475.5 nm左右对用于1G4→3H6，510.5 nm左右对用于1D2→3H5，646.5 nm左右对用于1G4→3F4，802.5 nm左右对用于3H4→3H6。

图2  Yb3+离子和Tm3+离子的能级跃迁图以及NaYF4:Yb/Tm的上转换发光机制

图2为Yb3+离子和Tm3+离子的能级跃迁图以及β-NaYF4:18%Yb,0.5%Tm的上转换发光机制，图中我们给出了样品各个上转换发射峰的电子布居过程。在980nm红外激光激发下，Yb3+离子首先被激发，然后通过三步能量传递过程来布居Tm3+蓝色上转换发光能级1G4。第 一步：2F5/2→2F7/2(Yb3+):3H6→3H5(Tm3+)；第二步：Tm3+处于3H5能级上的电子快速无辐射弛豫到3F4能级，然后吸收一光子布居到3F2，3能级，2F5/2→2F7/2(Yb3+):3F4→3F2,3(Tm3+)；第三步：处于3F2,3能级上的电子快速无辐射弛豫到3H4能级，再吸收一光子能量布居到1G4能级，2F5/2→2F7/2(Yb3+):3H4→1G4(Tm3+)。布居1D2能级是通过能量传递3F2,3→3H6(Tm3+):3H4→1D2(Tm3+)完成的，为四光子过程。布居1I6能级是通过2F5/2→2F7/2(Yb3+):1D2→3P2(Tm3+)，3P2能级上的电子再无辐射弛豫到1I6能级，这一能量传递过程为五光子过程。

二、上转换荧光寿命

     采用北京卓立汉光自主研发生产的OmniFluo“卓谱”荧光寿命测量系统测试NaYF4:Yb/Tm的上转换荧光寿命，激发光源选用980nm固体激光器，激光器调制频率为50Hz，积分时间为1μs，测试发射波长分别为345nm、450nm、475nm，分别如图3、图4、图5所示。

图3 发射波长345nm

图4 发射波长451nm

图5 发射波长475nm

结论：
    多光子参与的上转换发光过程能够将低频率的激发光转换成高频率的发射光，在能源、YL、环保和通信等领域都有着重要的应用。北京卓立汉光自主研发生产的OmniFluo“卓谱”荧光寿命测量系统，配备可调频980nm固体激光器(可根据客户需求，配置其它波长激光器)。当测试样品的上转换荧光光谱时，激光器工作于稳态模式，便于调节光路；当测试样品的上转换荧光寿命时，可直接对激光器进行调频，无需重新调节光路和样品的摆放位置，即可得到测试结果。这样既节省了换用激光器的调试时间，又保证了测量的准确定，是您测试上转换荧光以及荧光寿命的选择。

OmniFluo“卓谱”荧光寿命测量系统

【本文作者：分析仪器事业部（AID）应用研发部石广立工程师】

（来源：北京卓立汉光仪器有限公司）

序言

上转换发光材料 (Upconversion phosphors material,UPM) 是一类在长波长激发下发射短波长光的材料， 其特点是所吸收的光子能量低于发射的光子能量。 由于使用红外光作为激发光源， 此类材料在防伪标记、 激光探测和立体显示上的用途已经广为人知。 Z近几年来 , 科学家们又发现上转换发光材料有不易发生光漂白和发光强度高等优点 , 用在生物标记中可以大大提高检测灵敏度和线性范围， 因此上转换发光材料的荧光发射光谱是表征其性能的一个重要指标， 具有非常重要意义。

与传统典型的荧光发光过程（ 只涉及一个基态和一个激发态）不同， 上转换过程需要许多中间态来累积低频的激发光子的能量。 其中主要有三种发光机制： 激发态吸收、 能量转换过程、 光子雪崩。 这些过程均是通过掺杂在晶体颗粒中的激活离子能级连续吸收一个或多个光子来实现的，而那些具有 f 电子和 d 电子的激活离子因具有大量的亚稳能级而被用来上转换发光。然而GX率的上转换过程，只能靠掺杂三价稀土离子实现，因其有较长的亚稳能级寿命。稀土离子的吸收和发射光谱主要来自内层 4f 电子的跃迁。 在外围 5s 和 5p 的电子的屏蔽下，其 4f 电子几乎不与基质发生相互作用， 因此掺杂的稀土离子的吸收和发射光谱与其自由离子相似，显示出极尖锐的峰（ 半峰宽约 10-20nm） 。而这同时就对外部激发光源的波长有了很大的限制。激光荧光光谱技术用于化学检测领域具有信噪比高、灵敏度好、检测快速等优点，特别是对于上转换材料的发光检测。商业化的 980nm 激光光源系统恰巧与它的吸收相匹配，为上转换纳米材料提供了理想的激光激发光源。

PerkinElmer 是世界上Z主要的荧光分光光度计生产商，也是技术上Zling先的高端仪器供应商。PerkinElmer 公司是SJ采用脉冲氙灯做光源， 具有荧光、 磷光和化学发光三种测量模式， 在磷光和化学发光模式下， 仪器内部激发光源自动关闭， 这样就为 980nm 激光光源的使用提供了便利的条件， 也为上转换纳米材料的荧光发光测试提供了硬件基础， 而其它厂家大多数使用传统的连续氙灯， 不能通过软件将其关闭， 在使用激光光源时， 只能通过遮挡的方式将出光孔堵住； PerkinElmer 公司采用脉冲氙灯光源， 就可以很好的在内部光源与外部激光光源之间进行切换， 当需要使用外部激光光源系统时，只需要通过软件选择激光测定模式即可， 不需要通过其它物理遮挡方式， 来遮挡仪器原有的激发光源， 这是PerkinElmer 公司优于其它公司的重要技术之一。 这种操作不仅延长了原有氙灯的使用寿命， 而且也很好的限制了由于物理遮挡导致的杂散光影响； 另外， 由于采用了灵活的可拆卸的样品架套筒设计， 如图 1 所示， 不仅固定了激光光源的输出端， 使之与样品池垂直， 保证激光光源能够准确的照射到待测样品上而且， 在进行常规荧光测定时， 容易取下， 大大简化了操作的繁琐性。

硬件配置

主机： LS-55 型荧光分光光度计 ( 图 2)

附件： 激光光源及可拆卸样品池套筒（图 1）

图 1. 激光光源及可拆卸样品池架套筒

图 2. PerkinElmerLS-55 荧光光谱仪

样品测试

测试条件

测试模式： 激光测定模式

延迟时间： 0ms

扫描范围： 300-700nm

扫描速度： 1000nm/min

测试结果

改变不同条件测试 UCNP 上转换材料得到的荧光发射谱图， 如下图 3 所示。 从图可以看出样品在357nm、473nm、 645nm 有荧光发射峰， 这三个发射峰是 UCNP三个能级的光子发射， 其中在 473nm 处Z强， 且荧光发射峰窄且尖锐， 半峰宽大约 10nm， 测试结果令人满意。

图 3. 样品荧光发射谱图

结论

PerkinElmer 公司的 LS-55 荧光光谱仪连接激光做光源的荧光分析方法能够准确的测试上转换材料的荧光发射峰，测试结果良好， 为上转换材料的发光表征提供了wan美的解决方案。 该方法操作简单， 使用方便， 成本低廉， 能够满足绝大多数样品的测试， 并且易于拆卸， 也能满足常规样品的测试， 是一个非常实用的解决方案。

前言

许多发光材料的发光特性随温度、压力或化学物质的存在而变化。这种特性在发光传感器的开发中得到了长期的应用。除了化学传感外，发光测温法也是最常用的传感方法之一。与其他方法不同，它不需要宏观的探针与探测区域进行物理接触。这是发光测温法无可比拟的优势。例如，可以功能化的发光纳米颗粒进入生物靶，荧光显微镜可以准确探测不同区域的温度。这种纳米测温法在医学领域有很大的潜力，如：对温度高于平均值的癌细胞进行成像[1]。

发光测温可以根据强度、线宽、光致发光寿命或光谱位移的变化来进行。由于镧系离子的稳定性和窄光谱特性，很容易识别到这些变化，因此在温度传感的应用中经常使用镧系离子[2]。此外，镧系掺杂材料呈现上转换发光性质: 可被近红外(NIR)光激发，在光谱可见光区发射。近红外光谱激发减少了生物组织的自吸收和散射，因此远程激励变得更加容易。由于这一性质，越来越多的温度生物成像研究使用无机纳米掺杂镧离子制备上转换纳米颗粒 (UCNPs)[3]。

图1. NaY0.77Yb0.20Er0.03F4上转换发光机理的结构示意图，其中红色和绿色的线代表发射跃迁。灰色的线代表非辐射跃迁。

图1是上转换荧光粉NaY0.77Yb0.20Er0.03F4发光机理的示意图。至少需要两个980nm的光子去激发样品来产生可见区的发射。除了直接激发Er3+离子外，还存在从激发态Yb3+与Er3+激发态的能量转移，该材料在可见光光谱的蓝色、绿色和红色区域发光。取决于跃迁过程中Er3+能级的高低。上转换的测温法通常集中使用525nm和540nm两个波长的发射峰，分别对应2H11/2 →4I15/2和4S3/2 → 4I15/2能级跃迁。2H11/2和2H11/2两个能级在能量上紧密间隔，他们实际处于热平衡状态。因此，它们的粒子数比例可以用玻尔兹曼分布来表示:

式中，Ni是能级i上的粒子数，Δe是两个能级间的能量差，k是玻尔兹曼常数，C是简并常数。

基于此，525nm与540nm处荧光强度的比值RHS可用来推出2H11/2与4S3/2的比值，从而能够计算出样品的温度。爱丁堡(Edinburgh Instruments）荧光光谱仪FLS1000通过光纤耦合变温台能够完成该测试项目。此变温台不仅能够保证在FLS1000和显微镜下研究的为同一样品，并且没有任何中间样品转移步骤。本文通过FLS1000荧光光谱仪耦合变温台对上转换样品NaY0.77Yb0.20Er0.03F4进行不同温度下上转换发光的测试。

测试方法与样品

测试样品为NaY0.77Yb0.20Er0.03F4上转换发光粉末，购置于Sigma Aldrich。将样品放置于Linkam HFS350EV-PB4冷热台里的石英样品池中。通过光纤将冷热台与FLS1000样品仓相连接。使用稳态光源Xe2 980nm进行激发，激光能量要低，以防止样品变热。使用980nm的激光器往往会造成样品受激光照射而变热[4]。FLS1000配置：双单色器，标准检测器PMT-900。时间分辨的寿命测试使用脉冲氙灯(μF2)作为激发光源，采用MCS模式测试发光寿命。

测试结果与讨论

使用FLS1000的Fluoracle中温度mapping的测试功能，分别测试从-100℃到80℃每间隔20℃温度范围内，样品上转换发射的红光及绿光随温度的变化情况。结果如图2（上转化绿光）和3（上转换红光）所示。图2 中上转换绿光发射峰是由于Er3+的2H11/2 →4I15/2和4S3/2 → 4I15/2两个能级跃迁产生的。4S3/2 → 4I15/2和4F9/2 → 4I15/2对应发射峰的强度随着温度升高而降低。但是2H11/2 → 4I15/2对应的谱待变化的稍有不同：在273K以下，随着温度的增加其发光强度降低。但当温度继续升高时，增长缓慢。

图2. NaY0.77Yb0.20Er0.03F4温度相关的发射图谱（绿光部分）。使用耦合Linkam冷热台的FLS1000光谱仪进行测试。测试条件：λex=980 nm, Δλex=10 nm, Δλem=10 nm, 步进step=0.10nm, 积分时间=1s/step。内插图为对应2H11/2→ 4I15/2跃迁的发射范围的放大图。

图3. NaY0.77Yb0.20Er0.03F4温度相关的发射图谱（红光部分）。使用耦合Linkam冷热台的FLS1000光谱仪进行测试。测试条件：λex=980nm, Δλex=10nm, Δλem=10nm, 步进step=0.10nm, 积分时间=1s/step。

图4. NaY0.77Yb0.20Er0.03F4温度相关的寿命三维谱图。使用耦合Linkam冷热台的FLS1000光谱仪进行测试。测试2H11/2→ 4I15/2对应的发射。测试条件：λex=980nm, Δλex=15nm, λem=541nm ，Δλem=10nm, 灯源频率=100Hz, 采集时间：每条衰退曲线采集5分钟。红色和蓝色曲线分别代表-100℃和40℃下的测试结果。随着温度的增加，非辐射弛豫过程降低了整体的上转换发光过程。有关温度的猝灭的动力学可以通过图4所示的温度相关的三维寿命谱图来进行研究，当温度增加时，该样品的发光寿命从640μs降低至530μs，有明显下降。回到图2和图3，从4S3/2 ，2H11/2 到4F9/2的弛豫过程相对增加了红色光的发射强度。这可以从图5（a）的温度Rrg函数看出。2H11/2 →4I15/2和4S3/2 → 4I15/2的比值，RHS是优异的温度指数参数(前言已介绍过)，图5（b）是RHS随温度的变化图，图5（c）是相同数据的对数值。有趣的是，RHS并没有遵循玻尔兹曼曲线：在高温下，额外的弛豫过程发生并引发4S3/2 → 4I15/2跃迁的“缓慢增加”。这与之前的报告一致[5,6]，证明了上转换的复杂动力学过程: 4H11/2到 4S3/2的非辐射过程在高温下变得更为重要，所以粒子数与RHS不相等。应该指出不同温度下的RHS 很大程度上取决于样品颗粒的大小[4,6]。为了说明上转换测温的概念，将曲线的低温区域拟合到图5 (c)所示的直线玻尔兹曼图中，可以得到荧光测温系统S的相对灵敏度。这是评价发光温度计系统的一个有用参数，计算方法如下:

图5的斜率为-ΔE/k, 在20℃的灵敏度为1.0%K-1。这一结果与类似的上转换测温系统是一致的。

图5.  上转换发射带强度的比值随温度变化的函数图：（a）红光和绿光的比值（b）2H11/2 →4I15/2和4S3/2 → 4I15/2的比值 (c) 图(b)的对数数据图。与玻尔兹曼图第 一部分的线性拟合如(c)所示。

结论

NaY0.77Yb0.20Er0.03F4温度相关上转换发光强度及寿命均可使用爱丁堡荧光光谱仪FLS1000 耦合Linkam冷热台进行测试。2H11/2 →4I15/2和4S3/2 → 4I15/2的比值可作为发光测温系统中的温度探针，其灵敏度为1.0%K-1。通过光纤耦合的Linkam冷热台附件能够使用户在发光测试和显微镜下灵活轻松切换，中途不需要样品转移步骤。

参考文献

[1] C. D. S. Brites, et al., Nanoscale 4, 4799-4829 (2012)
[2] M. D. Dramianin, Methods Appl. Fluoresc. 4, 042001 (2016)
[3] M. González-Béjar and J. Pérez-Prieto, Methods Appl. Fluoresc. 3, 042002 (2015)
[4] S. Zhou, et al., Optics Communications 291, 138-142 (2013)
[5] X. Bai, et al., J. Phys. Chem. C 111, 13611-13617 (2007)
[6] W. Yu, et al., Dalton Trans. 43, 6139-6147 (2014)