光学显微镜和电子显微镜的原理?

光学显微镜的组成结构

光学显微镜包括光学系统和机械装置两大部分，而数码显微镜还包括数码摄像系统，现分述如下：

（一）机械装置

1．机架显微镜的主体部分，包括底座和弯臂。

2．目镜筒位于机架上方，靠圆形燕尾槽与机架固定，目镜插在其上。根据有否摄像功能，可分为双目镜筒和三目镜筒；根据瞳距的调节方式不同，可分为铰链式和平移式。

3．物镜转换器它是一个旋转圆盘，上有3～5个孔，分别装有低倍或高倍物镜镜头。转动物镜转换器就可让不同倍率的物镜进入工作光路。

4．载物台是放置玻片的平台，其ZY具有通光孔。台上有一个弹性的标本夹，用来夹住载玻片。右下方有移动手柄，使载物台面可在XY双方向进行移动。

5．调焦机构利用调焦手轮可以驱动调焦机构，使载物台作粗调和微调的升降运动，从而使被观察物体对焦清晰成像。

6．聚光器调节机构聚光器安装在其上，调节螺旋可以使聚光器升降，用以调节光线的强弱。

（二）光学系统

1．目镜它是插在目镜筒顶部的镜头，由一组透镜组成，可以使物镜成倍地分辨、放大物像，例如10X、15X等。按照所能看到的视场大小，目镜可分为视场较小的普通目镜，和视场较大的大视场目镜(或称广角目镜)两类。较显微镜的目镜上还装有视度调节机构，操作者可以方便快捷地对左右眼分别进行视度调整；此外，在这些目镜上可以加装测量分划板，测量分划板的象总能清晰地调焦在标本的焦面上；并且，为了防止目镜被取走以及减少运输中被损坏的可能性，这些目镜可以被锁定。

2．物镜它安装在转换器的孔上，也是由一组透镜组成的，能够把物体清晰地放大。物镜上刻有放大倍数，主要有10X、40X、60X、100X等。高倍物镜中多采用浸液物镜，即在物镜的下表面和标本片的上表面之间填充折射率为1.5左右的液体（如杉木油），它能显著的提高显微观察的分辨率。

3．光源有卤素灯、钨丝灯、汞灯、荧光灯、金属卤化物灯等。

4．聚光器包括聚光镜、孔径光阑。聚光镜由透镜组成，它可以集中透射过来的光线，使更多的光能集中到被观察的部位。孔径光阑可控制聚光器的通光范围，用以调节光的强度。

（三）数码摄像系统

1．摄像头

2．图像采集卡

3．软件

4．微机

五、光学显微镜的分类

光学显微镜有多种分类方法：按使用目镜的数目可分为双目和单目显微镜；按图像是否有立体感可分为立体视觉和非立体视觉显微镜；按观察对像可分为生物和金相显微镜等；按光学原理可分为偏光、相衬和微差干涉对比显微镜等；按光源类型可分为普通光、荧光、紫外光、红外光和激光显微镜等；按接收器类型可分为目视、数码（摄像）显微镜等。常用的显微镜有双目体视显微镜、金相显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜等。

1．双目体视显微镜

双目体视显微镜又称"实体显微镜"或"解剖镜"，是一种具有正象立体感地目视仪器。在生物、医学领域广泛用于切片操作和显微外科手术；在工业中用于微小零件和集成电路的观测、装配、检查等工作。它具有如下特点：

（1）利用双通道光路，双目镜筒中的左右两光束不是平行，而是具有一定的夹角--体视角（一般为12度--15度），为左右两眼提供一个具有立体感的图像。它实质上是两个单镜筒显微镜并列放置，两个镜筒的光轴构成相当于人们用双目观察一个物体时所形成的视角，以此形成三维空间的立体视觉图像。

（2）象是直立的，便于操作和解剖，这是由于在目镜下方的棱镜把象倒转过来的缘故。

（3）虽然放大率不如常规显微镜，但其工作距离很长。

（4）焦深大，便于观察被检物体的全层。

（5）视场直径大。

目前体视镜的光学结构是：由一个共用的初级物镜，对物体成象后的两光束被两组中间物镜----变焦镜分开，并成一体视角再经各自的目镜成象，它的倍率变化是由改变中间镜组之间的距离而获得的，因此又称为"连续变倍体视显微镜"（Zoom-stereomicroscope）。随着应用的要求，目前体视镜可选配丰富的选购附件，如荧光，照相，摄象，冷光源等等。

2．金相显微镜

金相显微镜是专门用于观察金属和矿物等不透明物体金相组织的显微镜。这些不透明物体无法在普通的透射光显微镜中观察，故金相和普通显微镜的主要差别在于前者以反射光，而后者以透射光照明。在金相显微镜中照明光束从物镜方向射到被观察物体表面，被物面反射后再返回物镜成像。这种反射照明方式也广泛用于集成电路硅片的检测工作。

3．偏光显微镜（Polarizingmicroscope）

偏光显微镜是用于研究所谓透明与不透明各向异性材料的一种显微镜。凡具有双折射的物质，在偏光显微镜下就能分辨的清楚，当然这些物质也可用染色法来进行观察，但有些则不可能，而必须利用偏光显微镜。

（1）偏光显微镜的特点

将普通光改变为偏振光进行镜检的方法，以鉴别某一物质是单折射（各向同行）或双折射性（各向异性）。双折射性是晶体的基本特性。因此，偏光显微镜被广泛地应用在矿物、化学等领域，在生物学和植物学也有应用。

（2）偏光显微镜的基本原理

偏光显微镜的原理比较复杂，在此不作过多介绍，偏光显微镜必须具备以下附件：起偏镜，检偏镜，补偿器或相位片，专用无应力物镜，旋转载物台。

（3）偏光镜检术的方式

a.正相镜检（Orthscope）:又称无畸变镜检，其特点是使用低倍物镜，不用伯特兰透镜（BertrandLens），被研究对象可直接用偏振光研究。同时为使照明孔径变小，推开聚光镜的上透镜。正相镜检用于检查物体的双折射性。

b.锥光镜检（Conoscope）：又称干涉镜检，研究在偏振光干涉时产生的干涉图样，这种方法用于观察物体的单轴或双轴性。在该方法中，用强会聚偏振光束照明。

（4）偏光显微镜在装置上的要求

a.光源：Z好采用单色光，因为光的速度，折射率，和干涉现象由于波长的不同而有差异。一般镜检可使用普通光。

b.目镜：要带有十字线的目镜。

c.聚光镜：为了取得平行偏光，应使用能推出上透镜的摇出式聚光镜。

d.伯特兰透镜：聚光镜光路中的辅助部件，这是把物体所有造成的初级相放大为次级相的辅助透镜。它可保证用目镜来观察在物镜后焦平面中形成的平涉图样。

（5）偏光镜检术的要求

a.载物台的ZX与光轴同轴。

b.起偏镜和检偏镜应处于正交位置。

c.制片不宜过薄。

4．荧光显微镜

荧光显微镜是用短波长的光线照射用荧光素染色过的被检物体，使之受激发后而产生长波长的荧光，然后观察。荧光显微镜广泛应用于生物，医学等领域。

（1）荧光显微镜一般分为透射和落射式两种类型。

a.透射式：激发光来自被检物体的下方，聚光镜为暗视野聚光镜，使激发光不进入物镜，而使荧光进入物镜。它在低倍情况下明亮，而高倍则暗，在油浸和调中时，较难操作，尤以低倍的照明范围难于确定，但能得到很暗的视野背景。透射式不使用于非透明的被检物体。

b.落射式：透射式目前几乎被淘汰，新型的荧光显微镜多为落射式，光源来自被检物体的上方，在光路中具有分光镜，所以对透明和不透明的被检物体都适用。由于物镜起了聚光镜的作用，不仅便于操作，而且从低倍到高倍，可以实现整个视场的均匀照明。

（2）荧光镜检术的注意事项

a.激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象，因此尽可能缩短观察时间，暂时不观察时，应用挡板遮盖激发光。

b.作油镜观察时，应用"无荧光油"。

c.荧光几乎都较弱，应在较暗的室内进行。

d.电源Z好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。

目前许多新兴生物研究领域应用到荧光显微镜，如基因原位杂交（FISH）等等。

5．相衬显微镜（Phasecontrastmicroscope）

在光学显微镜的发展过程中，相衬镜检术的发明成功，是近代显微镜技术中的重要成就。我们知道，人眼只能区分光波的波长（颜色）和振幅（亮度），对于无色通明的生物标本，当光线通过时，波长和振幅变化不大，在明场观察时很难观察到标本。

相衬显微镜利用被检物体的光程之差进行镜检，也就是有效地利用光的干涉现象，将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差，即使是无色透明的物质也可成为清晰可见。这大大便利了活体细胞的观察，因此相衬镜检法广泛应用于倒置显微镜中。

相衬镜检法在装置上与明场不同，有一些特殊要求：

a.环状光阑（Ringslit）:装在聚光镜的下方，而与聚光镜组合为一体---相衬聚光镜。它是由大小不同的环形光阑装在一圆盘内，外面标有10X、20X、40X、100X等字样，与相对应倍数的物镜配合使用。

b.相板（Phaseplate）:装在物镜的后焦平面处，它分为两部分，一是通过直射光的部分，为半透明的环状，叫共轭面；另一是通过衍射光的部分，?quot;补偿面"。有相板的物镜称"相衬物镜"，外壳上常有"Ph"字样。

相衬镜检法是一种比较复杂的镜检方法，想要得到好的观察效果，显微镜的调试非常重要。除此之外还应注意以下几个方面：

a.光源要强，全部开启孔径光阑；

b.使用滤色片，使光波近于单色。

6．微分干涉对比显微镜（DifferentialinterferencecontrastDIC）

微分干涉对比镜检术出现于60年代，它不仅能观察无色透明的物体，而且图象呈现出浮雕壮的立体感，并具有相衬镜检术所不能达到的某些优点，观察效果更为逼真。

（1）原理

微分干涉对比镜检术是利用特制的渥拉斯顿棱镜来分解光束。分裂出来的光束的振动方向相互垂直且强度相等，光束分别在距离很近的两点上通过被检物体，在相位上略有差别。由于两光束的裂距极小，而不出现重影现象，使图象呈现出立体的三维感觉。

（2）微分干涉对比镜检术所需的特殊部件：

a.起偏镜

b.检偏镜

c.渥拉斯顿棱镜2块

（3）微分干涉对比镜检时的注意事项

a.因微分干涉灵敏度高，制片表面不能有污物和灰尘。

b.具有双折射性的物质，不能达到微分干涉对比镜检的效果。

c.倒置显微镜应用微分干涉时，不能用塑料培养皿。

7．倒置显微镜（Invertedmicroscope）

倒置显微镜是为了适应生物学、医学等领域中的组织培养、细胞离体培养、浮游生物、环境保护、食品检验等显微观察。

由于上述样品特点的限制，被检物体均放置在培养皿（或培养瓶）中，这样就要求倒置显微镜的物镜和聚光镜的工作距离很长，能直接对培养皿中的被检物体进行显微观察和研究。因此，物镜、聚光镜和光源的位置都颠倒过来，故称为"倒置显微镜"。

由于工作距离的限制，倒置显微镜物镜的Z大放大率为60X。一般研究用倒置显微镜都配置有4X、10X、20X、及40X相差物镜，因为倒置显微镜多用于无色透明的活体观察。如果用户有特殊需要，也可以选配其它附件，用来完成微分干涉、荧光及简易偏光等观察。

目见倒置显微镜广泛应用于patch-clamp，transgeneICSI等领域。

8．数码显微镜

数码显微镜是以摄像头（即电视摄像靶或电荷耦合器）作为接收元件的显微镜。在显微镜的实像面处装入摄像头取代人眼作为接收器，通过这种光电器件把光学图像转换成电信号的图像，然后对之进行尺寸检测、颗粒计数等工作。这类显微镜可以与计算机联用，这便于实现检测和信息处理的自动化，多应用于需要进行大量繁琐检测工作的场合。

六、光学显微镜的使用规程

（一）实验时要把显微镜放在座前桌面上稍偏左的位置，镜座应距桌沿6～7cm左右。

（二）打开光源开关，调节光强到合适大小。

（三）转动物镜转换器，使低倍镜头正对载物台上的通光孔。先把镜头调节至距载物台1～2cm左右处，然后用左眼注视目镜内，接着调节聚光器的高度，把孔径光阑调至Z大，使光线通过聚光器入射到镜筒内，这时视野内呈明亮的状态。

（四）将所要观察的玻片放在载物台上，使玻片中被观察的部分位于通光孔的正ZY，然后用标本夹夹好载玻片。

（五）先用低倍镜观察（物镜10X、目镜10x）。观察之前，先转动粗动调焦手轮，使载物台上升，物镜逐渐接近玻片。需要注意，不能使物镜触及玻片，以防镜头将玻片压碎。然后，左眼注视目镜内，同时右眼不要闭合（要养成睁开双眼用显微镜进行观察的习惯，以便在观察的同时能用右眼看着绘图），并转动粗动调焦手轮，使载物台慢慢下降，不久即可看到玻片中材料的放大物像。

（六）如果在视野内看到的物像不符合实验要求（物像偏离视野），可慢慢调节载物台移动手柄。调节时应注意玻片移动的方向与视野中看到的物像移动的方向正好相反。如果物像不甚清晰，可以调节微动调焦手轮，直至物像清晰为止。

（七）如果进一步使用高倍物镜观察，应在转换高倍物镜之前，把物像中需要放大观察的部分移至视野ZY（将低倍物镜转换成高倍物镜观察时，视野中的物像范围缩小了很多）。一般具有正常功能的显微镜，低倍物镜和高倍物镜基本齐焦，在用低倍物镜观察清晰时，换高倍物镜应可以见到物像，但物像不一定很清晰，可以转动微动调焦手轮进行调节。

（八）在转换高倍物镜并且看清物像之后，可以根据需要调节孔径光阑的大小或聚光器的高低，使光线符合要求（一般将低倍物镜换成高倍物镜观察时，视野要稍变暗一些，所以需要调节光线强弱）。

（九）观察完毕，应先将物镜镜头从通光孔处移开，然后将孔径光阑调至Z大，再将载物台缓缓落下，并检查零件有无损伤（特别要注意检查物镜是否沾水沾油，如沾了水或油要用镜头纸擦净），检查处理完毕后即可装箱。

七、光学显微镜的维护

（一）必须熟练掌握并严格执行使用规程。

（二）取送显微镜时一定要一手握住弯臂，另一手托住底座。显微镜不能倾斜，以免目镜从镜筒上端滑出。取送显微镜时要轻拿轻放。

（三）观察时，不能随便移动显微镜的位置。

（四）凡是显微镜的光学部分，只能用特殊的擦镜头纸擦拭，不能乱用他物擦拭，更不能用手指触摸透镜，以免汗液玷污透镜。

（五）保持显微镜的干燥、清洁，避免灰尘、水及化学试剂的玷污。

（六）转换物镜镜头时，不要搬动物镜镜头，只能转动转换器。

（七）切勿随意转动调焦手轮。使用微动调焦旋钮时，用力要轻，转动要慢，转不动时不要硬转。

（八）不得任意拆卸显微镜上的零件，严禁随意拆卸物镜镜头，以免损伤转换器螺口，或螺口松动后使低高倍物镜转换时不齐焦。

（九）使用高倍物镜时，勿用粗动调焦手轮调节焦距，以免移动距离过大，损伤物镜和玻片。

（十）用毕送还前，必须检查物镜镜头上是否沾有水或试剂，如有则要擦拭干净，并且要把载物台擦拭干净，然后将显微镜放人箱内，并注意锁箱。

电子显微镜按成象原理不同有透射电子显微镜和扫描电子显微镜两类。
透射电镜成象原理与透射式光学显微镜完全相同，只不过是将可见光照明换成电子束照明，将玻璃透镜换成电磁透镜，将成象的毛玻璃换成荧光屏。由于成象透镜总是对通过它的光波有衍射效应（相当于小孔衍射），衍射效应会使象变得模糊，影响透镜的分辨率。可以计算照明源的波长越短，衍射效应的影响越小。电镜中使用的电子波的波长只是可见光的十万分之一，这样电镜的分辨率大大提高了。
扫描电镜成象就完全不同了，它是利用细聚焦高能电子束在样品表面扫描激发出各种物理信号，如二次电子、背反射电子等。通过相应的检测器来检测这些信号，再将其转换为视频信号来调制显像管的亮度。由于信号的强度与样品表面的形貌、成分有对应关系，那么逐点在样品上扫描一个面积，在显像管上就相应获得该面积样品表面的形貌或成分的一副图象。扫描的面积越小，放大倍数就越高。