酵母核糖核酸的分离和鉴定。实验原理

一、 实验目的
1、掌握酵母RNA提取的方法。
2、了解核酸的组成。
3、掌握鉴定核酸组分的方法和操作。
二、 实验原理
酵母核酸中RNA含量较多，DNA则少于2%。RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到RNA制品。但是用碱液提取的RNA有不同的降解。RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸等组分，加入硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在(见实验内容)
三、 实验步骤
1、 用托盘天平称1g干酵母于研钵中，加入少许石英砂，再加入2ml 0.04mol/LNaOH溶液，在研钵中充分研磨至少5min。
2、 再加4ml 0.04mol/LNaOH溶液于匀浆液中，混匀后，将匀浆液转移到大试管中，再用4ml 0.04mol/LNaOH溶液洗涤研钵，洗涤液并入匀浆液中。
3、 将大试管小心在沸水浴中加热30min，冷却后倒入离心管中，与另一组同学的离心管在托盘天平上平衡，然后两组的离心管对称地放入离心机中，2000r/min下离心15min。
4、 吸取10ml酸性乙醇溶液于小烧杯中，将离心管上清液小心倒入小烧杯中，边倒入边搅拌，直到RNA沉淀完全。
5、 将小烧杯中的液体倒入2个干净的离心管，平衡、离心（2000r/min）3min。
6、 弃去两离心管上清液，各离心管中加入95%乙醇2.5ml，振荡、混匀、平衡、离心（2000r/min）3min。
7、 弃去两离心管上清液，各离心管加入3ml 1.5mol/L硫酸，混匀、倒入同一个大试管中，贴上标签，放在试管架上，备用。
8、 将水解液在沸水浴中加热至少10min，使沉淀RNA充分水解。
9、 取一支试管A，加入1ml 0.1mol/L硝酸银溶液，再逐滴加入浓氨水至沉淀消失，然后加入1ml水解液放置片刻，观察有无白色嘌呤碱的银化合物沉淀。
10、 另取一支试管B，加入水解液1ml，三氯化铁浓盐酸溶液2ml和地衣酚乙醇溶液0.2ml（约4滴），混匀，用试管夹夹好后放到沸水浴中3~5min，注意观察溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。
11、 再取一支试管C，加入水解液1ml和定磷试剂1ml，混匀，在沸水浴中加热，注意观察溶液颜色的变化，溶液变蓝，说明磷酸存在。
注意事项：离心一定要平衡对称放入离心机中，离心机达到设置转速时才能离开。
四、 实验结果
第6步中离心管底部有不少的RNA沉淀。
试管A：出现白色浑浊现象。有嘌呤碱存在。
试管B：加热后，出现鲜绿色，且随着加热时间延长，颜色越来越深。有核糖存在。
试管C：加热后，出现蓝色，且随着加热时间延长，颜色越来越深。有磷酸存在。
说明RNA的组分中有嘌呤碱、核糖、磷酸。
分析：
本实验选用酵母，是因为酵母中RNA含量较多，且价格便宜。RNA可溶于碱性溶液，所以本实验用0.04mol/LNaOH溶液来提取。RNA不溶于乙醇，可用酸性乙醇使RNA从溶液中沉淀出来，再用乙醇洗涤沉淀，可得到RNA粗制品。
研磨和NaOH使酵母细胞破裂，RNA主要存在于细胞质中，所以RNA被释放出来，同时，NaOH使蛋白质变性。
加入酸性乙醇，一方面可以中和NaOH，另一方面，使RNA从溶液中沉淀下来。
RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸等组分，加入硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。
（1）、强酸使核酸分子的有机磷消化为无机磷，使之与钼酸铵结合成磷钼酸铵（黄色沉淀）
PO43- + 3NH4+ + 12MoO42- + 24H+ ===(NH4)3PO4.12MoO3.6H2O + 6H2O
当有还原剂（如维生素C）存在时，Mo6+被还原成Mo4+，再与试剂中的其它MoO42-结合成Mo（MoO4）2，呈蓝色，称钼蓝。所以试管C中会出现蓝色。
（2）、RNA与硫酸共热，生成的核糖进而脱水转化为糠醛，三氯化铁作为催化剂，可与地衣酚反应，生成绿色化合物，所以试管B中出现绿色。（OR苔黑酚）
（3）、嘌呤碱可与硝酸银反应产生白色的飘零银化合物沉淀。所以试管A中出现浑浊现象。
（4）、不检测嘧啶碱，是因为与嘌呤碱相比，它难以被水解下来，同时它难检测且现象不明显。

酵母核酸中RNA含量较多，DNA 则较少。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。
核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱、磷酸，加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可测出其组成成分。