谁用过TAKARA的 cDNA 文库合成试剂盒

是单链cDNA，想合成双链cDNA需要另外操作：一、cDNA第二链的合成:1. diyi链反应完成后，取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):20ul 10×DNA Polymerase I buffer6ul 10mM dNTP(自己配制)xul dd H2O1ul RNase H(2U/ul)10ul DNA Polymerase I(10U/ul)总体系为200ul;2. 混匀后，16℃反应2.5小时;3. 70℃灭活10分钟;4. 反应完成后，得到200ul cDNA第二链反应体系，将此体系置于冰上;5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。二、双链cDNA末端补平:1. 在第二链反应体系中，顺序加入下列试剂(promega):6ul 10mM dNTP2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul) 2ul BSA(10mg/ml)2. 稍微离心混匀反应物， 37℃反应至少30分钟，然后75℃灭活10分钟;3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇，剧烈振荡后，常温下13000g离心5分钟;4. 离心后，吸取上清于另一1.5ml eppendof管中，加入等体积氯仿，上下颠倒几次混匀后，常温下13000g离心5分钟;5. 吸取上清至另一eppendof管，加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇，混匀，-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;6. 第二日，将昨日沉淀物在4℃，13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;7.离心完毕，弃上清，加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀，常温下13000g离心5分钟;8.离心完毕，弃上清，干燥沉淀至无乙醇气味.注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。PCR纯化试剂盒操作流程：1．溶液PE使用前应加入适量体积95％－100％的乙醇，混匀。2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。3．加入spin column中，13000rpm离心1min。4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。5．13000rpm，再离心1min。6．将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。7．13000rpm离心2min。8．加入30ul buffer EB，静置10min。9．13000rpm离心2min。10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。