科技名词定义
中文名称：等电点 英文名称：isoelectric point 定义：蛋白质或两性电解质(如氨基酸)所带净电荷为零时溶液的pH，此时蛋白质或两性电解质在电场中的迁移率为零。符号为pI。 所属学科： 生物化学与分子生物学(一级学科) ；氨基酸、多肽与蛋白质(二级学科)
等电点聚焦测蛋白质等电点
一、实验原理
等电点聚集实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方
法。在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性电解载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的PH梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的PH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并Z终到达一个使其表面静电荷为零的区带，这时的PH则是这种蛋白质的PI。IEF技术的关键是得到一定范围的稳定的PH梯度。也即找到合适的两性载体。
二．实验试剂
1．丙烯酰胺单体储液
丙烯酰胺[Aa]30%[W/V]，甲叉双丙烯酰胺[Bis]0.8%[W/V]
2．核黄素 0.025%[W/V]
3．Ampholien PH3.5-9 凝胶工作液 Aa：Bis 1ml
甘油 0.25ml
Ampholine PH 3.5-9 0.4ml
双蒸水 3.25ml
摇匀，用水泵抽气10分钟，加入0.025%核黄素0.15ml，摇匀后用滴管灌入玻管中。
4．25%[W/V]蔗糖水溶液，用于配制蛋白样品
5．10%蔗糖水溶液，用来铺于样品层上部。
6．电极液： 上槽 0.02M H3PO4 1000ml
下槽 0.01M NaOH 600ml
7．染色液： 0.01%考马斯亮蓝R-250
5%三
5%磺基水杨酸
三．实验仪器与器具
玻璃管4×120mm 4支
封口膜
试管架
细长滴管
注射器及长针头
玻片、刀片
10ml玻璃瓶
微量可调移液器
圆盘电泳槽及电泳仪
四．操作步骤
1．圆柱体凝胶制备，用封口膜将玻管（4×120mm）的一端封口，将玻管套上橡皮塞，加入凝胶混合液至10cm处，轻轻铺上一层双蒸水，置于日光灯下待其聚合。
2．聚焦电泳
（1）将电泳下槽注入0.01M NaOH、将套有橡胶塞的玻璃管插入电泳槽（注意塞紧所有的孔，以防电极液下露）。将上槽连同电泳管置于下槽上，此时凝胶下端与电极液接触，注意排除凝胶下表面的气泡。
（2）加样100μl蛋白含量2-5μg。
（3）在样品上轻轻一层10%的蔗糖，直至顶端，作为隔离层。
（4）上槽注入0.02M H3PO4，注意不要搅混样品层和隔离层。
（5）接上电源，正极接酸，负极接碱。恒定在120V，通电16-18小时至电流降至0为止。
3．蛋白质染色及等电点测定：
（1）取胶 将凝胶后的含样品的凝胶借助长注射器针头注水取出。
（2）蛋白样品的染色由于两性载体Ampholine可与多种蛋白染色剂结合，并形成不溶性复合物，因此一般需要染色前除去Ampholine。本实验直接将凝胶置于三中浸泡，立刻可见蛋白带。
（3）PH梯度测定 取液，分别加入于10只小玻璃瓶中，将欲测的PH梯度的胶条置于玻璃片上，用刀片切成长的小段，按顺序放入有编号的小玻璃瓶中，盖好橡皮塞，将凝胶段在室温下浸泡过夜，次日用PH计测每支小瓶中浸泡液PH值。将得到的PH值对凝胶长度作图，得标准曲线。
（4）样品的PH值测定。测定出染色蛋白带的位置，在PH梯度曲线上求出相对应PH值既是此样品的PI。
五．实验结果
测定十个小管中胶条的PH分别为7.14、7.86、7.50、6.96、6.38、5.74、5.10、4.49、4.13。以胶条距碱端的距离为横坐标，PH值为纵坐标作图：
经过测量，待测蛋白距碱端为7.3cm，浸泡后胶的总长度为10.5cm，等比例换算得距离应为6.95，带入公式得待测蛋白的PI值为：4.64 查表得知与牛血清白蛋白的等电点接近。
六、讨论
1、载体两性电解质含量2％~3%比较适合，能形成好的梯度。
2、制胶用丙稀酰胺Z好是重结晶的。过硫酸铵要新配的。所有的水都要用重蒸水。
3、样品必须无盐，否则电泳时样品条带可能走歪，拖尾或者根本不成条带。加样的量要适当，避免过多电泳后条带不清晰。
4、由于碱性漂移作用，胶条碱端Z初1cm的pH值过低，故作图时舍去。
（5）本实验结果中同时加入待测和以前提取两种蛋白（未发现条带，可能样品含盐量过大），待测蛋白在三中固定后即可看到明显的白色条带，故未用染色液染色即可测量迁移距离。
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