组织培养如何扩繁菊花？

菊花的组织培养
教学内容：植物组织培养技术的基础知识，(包括植物组织培养的原理与基本过程， 影响植物组织培养的因素);以及植物组织培养的实验操作。
教学方式：探究式教学
技术准备：完成本课题需要配备无菌室、洁净工作台或接种箱，此外还需要配置常规植物组培用具，如高压灭菌锅、酒精灯、枪状镊、解剖剪、培养皿等。
[教学目标]
（一）知识目标：
1、熟悉植物组织培养的基本过程，了解影响植物组织培养的各种因素
2、理解细胞分化的概念及离体植物细胞的脱分化和再分化
3、归纳MS培养基的配制方法，并设计表格比较微生物培养基与MS培养基的配方的异同。
（二）能力目标：
掌握培养基制备、外植体消毒、接种、培养、移栽以及栽培等基本操作技术。
（三）情感、态度与价值观
1、通过联系农业生产实际，培养学生活学活用，理论联系实际的能力
2、通过阅读植物组织培养技术的发展史，课下查阅植物组织培养技术在生产实践中应用的资料，关注学生科学态度的教育，拓展学生视野，感受科学技术在生产实践中的重要价值。
[课题ZD]植物组织培养过程中使用的无菌技术
[课题难点]植物组织培养过程中使用的无菌技术
[教学工具]多媒体课件
[课时安排]2课时
[教学过程]
diyi课时 基础知识
导入:以人参的组织培养引入新课.
提问:如何进行植物组织培养?
一、植物组织培养的原理与基本过程
1、学生自学后分组讨论，简述植物组织培养的理论基础和基本过程.
学生回答后教师播放课件，并在此基础上归纳:
(1)植物组织培养的理论基础:
当植物细胞脱离了原来所在植物体的器官或组织而处于离体状态时，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株（即细胞全能性）。
(2)植物组织培养的基本过程:离体的植物组织、器官或细胞(外植体)—（脱分化） —愈伤组织—（再分化）—长出丛芽——完整的植物体
2、学生对植物组织培养过程中有疑问的地方提问，并自主讨论:
如:什么是愈伤组织？什么是脱分化？什么是再分化？什么是外植体?
3、教师归纳总结:
细胞分化：植物的个体发育过程中，细胞在形态、结构和生理功能上都会出现稳定性的差异，形成这些差异的过程叫做细胞分化。
愈伤组织：离体的植物组织或细胞，培养一段时间后，会通过细胞有丝分裂，形成愈伤组织。愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。
脱分化（去分化）：由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化，或者叫做去分化。
再分化：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化。
外植体:用于离体培养的植物器官或组织片段.
二、影响植物组织培养的因素.
1、学生自学后分组讨论，有哪些因素会影响植物的组织培养.
学生回答:材料，营养，激素，pH、温度、光照等条件都有可能影响植物的组织培养.
2、教师指导并补充:
（1）材料因素的影响
不同的植物组织，培养的难易程度差别很大，容易进行无性繁殖的植物也容易进行组织培养。同一种植物材料，材料的年龄、保存时间的长短也有影响。幼龄、保存时间短的植物材料容易培养成功。菊花的组织培养，一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧芽。
（2）营养因素的影响
需要配置适宜的培养基，常用的一种培养基是 MS培养基，其主要成分包括：大量元素，如N、P、K、Ca、Mg、S；微量元素，如B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co；有机物，如甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素，以及蔗糖等。
（3）激素的影响
在配置好的MS培养基中，常常需要添加植物激素。植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。植物激素的浓度、使用的先后顺序以及用量的比例等，都会影响实验结果。
①按照不同的顺序使用这两类激素，会得到不同的实验结果。

使用顺序

实验结果

先使用生长素，后使用细胞分裂素

有利于细胞分裂，但细胞不分化

先使用细胞分裂素，后使用生长素

细胞既分裂又分化

同时使用

分化率提高

②当同时使用这两类激素时，两者用量的比例影响植物细胞的发育方向。

生长素用量比细胞分裂素用量

植物细胞的发育方向

比值高时

有利于根的分化、YZ芽的形成

比值低时

有利于芽的分化、YZ根的形成

比值适中时

促进愈伤组织的生长

（4）pH、温度、光照等条件的影响
不同的植物对各种条件的要求往往不同。进行菊花的组织培养，一般将pH控制在5.8左右，温度控制在18～22℃，并且每日用日光灯照射12h。
3、巩固练习:
你能说出MS培养基中各种营养物质的作用吗？同ZT2中微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？
微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。
三、小结
1、学生自主总结本节课的重要内容。
2、教师归纳总结。
第二课时 实验操作

一、学生自学后简述植物组织培养的实验操作过程：
制备MS固体培养基——外植体消毒——接种——培养——移栽
二、教师归纳总结，并引导学生学习具体操作过程及注意事项:
(一)、制备MS固体培养基：
1、学生自学后简述制备MS固体培养基的过程和方法。
①配置各种母液
将各种成分按比例配制成浓缩液，使用时，根据浓缩液比例计算用量，加水稀释。
②配置培养基
③灭菌
2、分组讨论制备MS固体培养基过程中的注意事项。
培养基和其他器械要一起高压蒸汽灭菌。
3、教师总结。
(二)、外植体消毒：
1、学生自学后讨论外植体消毒的过程：
流水冲洗→软刷刷洗→流水冲洗20min→无菌吸水纸吸干外植体表面→体积分数为70﹪的酒精中摇动2～3次，持续6～7s→无菌水清洗→无菌吸水纸吸干外植体表面→质量分数为0.1﹪的溶液中1～2min→无菌水中至少清洗3次。
2、教师总结注意事项：
对外植体进行表面消毒时，既要考虑药剂的消毒效果，又要考虑植物的耐受能力。
(三)、接种：
接种前用体积分数为70%的酒精将工作台擦拭一遍。将装有培养基的锥形瓶整齐地排列在酒精灯左侧。将消过毒的菊花茎段在无菌培养皿中切成小段（长约0.5～1cm）。左手持锥形瓶，右手拉开捆扎锥形瓶的绳子，并将封口膜攥于右手手心，以避免封口膜接触瓶口的一面被污染。左手持瓶，使瓶口旋转通过火焰；右手用镊子夹取菊花茎段，插入培养基中。插入时应注意方向，不要倒插。接种后，将封口膜重新扎好。
(四)、培养：
在无菌箱中培养，温度控制在18～22℃，每日用日光灯光照12h。
(五)、移栽
先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间培养几日。然后用清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间，等幼苗长壮后再移栽到土土壤中。
(六)、栽培：
将幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗生长情况，适时浇水、施肥，直至开花。

三、教师精讲实验注意事项：
1、无菌技术是植物组织培养能否获得成功的关键
①植物组织培养不同于扦插、分根、叶插等常规无性繁殖。由于植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，所以对培养条件的要求较高。用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长，如一些细菌、真菌等的生长。而培养物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此要进行严格的无菌操作。
②无菌技术包括培养基消毒灭菌和植物材料（外植体）的消毒灭菌。对培养材料进行表面灭菌时，一方面要考虑药剂的消毒效果；另一方面还要考虑植物材料的耐受能力。不同药剂、不同植物材料，甚至不同器官要区别对待。
③对接种操作中污染情况的分析：接种3～4 d后，在接种操作中被杂菌污染的培养物会表现出被污染的现象。一般情况下，细菌污染可能是由接种人员造成的，如未戴口罩，接种时说话，或手及器械消毒不严等。真菌污染可能是植物材料灭菌不当。
④妥善处理被污染的培养物：操作后常出现培养物被污染的情况。一旦发现培养材料被污染，特别是真菌性污染，一定不要打开培养瓶。应先将所有被污染的培养瓶统一放在高压蒸汽锅内进行高压蒸汽灭菌，然后再打开培养瓶，进行清洗。
⑤有品的用后处理：外植体灭菌用过的有品要妥善处理（如等），以免引起环境污染。
2、设置对照实验和重复组
①通过设置重复组和对照组可以选出Z佳的实验材料、Z好的培养基配方、找出实验失败的原因。如设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作是否合格，有没有被杂菌污染。
②不同组的同学设置不同的激素浓度，相互比较植物生长的速度。

四、结果分析与评价
定期观察生长状态并记录，如果出现问题，及时分析处理。
（一）选材是否恰当：要选取生长旺盛的嫩枝。
（二）无菌技术是否过关：如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。
（三）接种是否成功：如果接种的外植体长出愈伤组织或释放出胚状体，组织培养的diyi步就成功了。要适时转换培养基，以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株。

五、巩固练习：
1、在选取菊花茎段的时候，为什么要选取生长旺盛的嫩枝？
外植体的生理状态是成功进行组织培养的重要条件之一。生长旺盛的嫩枝生理状态良好，容易诱导脱分化和再分化。
稳定性的差异，形成这些差异的过程叫做细胞分化。
愈伤组织：离体的植物组织或细胞，培养一段时间后，会通过细胞有丝分裂，形成愈伤组织。愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。
脱分化（去分化）：由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化，或者叫做去分化。
再分化：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化。
外植体:用于离体培养的植物器官或组织片段.