由cDNA全长怎么得到DNA全长

以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA。步骤的话应该与DNA复制过程类似，需要的原料是mRNA模板，四中脱氧核糖核苷酸，逆转录酶，还有能量，注意：这样获得的DNA片段不含非编码区序列。以下是专业回答一).构建cDNA文库：以生物细胞的总mRNA为模板，用反转录酶合成互补的双链cDNA，然后接到载体上，转入到宿主后建立的基因文库就是cDNA文库。1、mRNA的提取及其完整性的确定1）总RNA的提取RNA提取方法：APGC法或NP-40或应用试剂盒提取总RNA2）mRNA的分离高等真核生物mRNA分子的3'端均有poly(A)尾，将总RNA通过寡聚（DT）纤维柱分离mRNA或利用磁珠法制备纯mRNA。在某些情况下，裂解细胞后用蔗糖梯度来制备mRNA-核糖体复合物作为提取mRNA的替换途径。3）mRNA的纯化①按照大小对总mRNA进行分级，主要用琼脂糖凝胶电泳和蔗糖密度梯度离心法进行分级；②多聚核糖体的免疫学纯化法，这是利用抗体来纯化合成目的多肽的方法。4）mRNA完整性的确定确定mRNA完整性的方法有三种：①直接检测mRNA分子的大小；②测定mRNA的转译能力；③检测总mRNA指导合成cDNAdiyi链长分子的能力。2、cDNA的合成和克隆1）cDNAdiyi链的合成用亲和层析法得到mRNA后，根据mRNA分子的3'端有poly(A)尾结构的原理，用12~20个核苷酸长的oligo（dT）与纯化的mRNA混合，oligo（dT）会与poly(A)结合作为反转录酶的引物，反转录反应的产物是一条RNA-DNA的杂交链。oligo（dT）结合在mRNA的3'端，因此合成全长的cDNA需要反转录酶从mRNA分子的一端移动到另一端，有时这种全合成难以达到，尤其是mRNA链很长时，为此建立了一种随机引物法合成cDNA。随机引物是一种长度为6~10个核苷酸，由4种碱基随机组成的DNA片段。与oligo（dT）仅与mRNA3'端结合不同，它们可以在mRNA的不同位点结合。随机引物法合成的产物也是RNA-DNA的杂交体。把cDNA克隆到载体中之前，必须把这种杂交体中的RNA转变成DNA链，即形成双链DNA分子。2）.双链cDNA的合成合成cDNA第二条链有两种方法。一种方法是利用cDNAdiyi链的3'末端常常出现发夹环的特征，这种发夹结构是反转录酶在diyi链末端“返折”并且进行复制diyi链的结果，它为合成cDNA第二链提供了有用的引物。用这种方法合成的双链cDNA在一端有一个发夹环，可以用单链特异的S1核酸酶切去。但是S1核酸酶的处理，常常会“修剪”过多的cDNA顺序，使cDNA丢失了mRNA5'端的部分顺序。另一种方法是用大肠杆菌的RNaseH进行修饰。RNaseH能识别RNA-DNA杂交分子并把其中的RNA切割成短的片段，这些RNA短片段仍与cDNAdiyi链结合，可被新合成的DNA所取代。新合成的DNA存在切口，用DNA连接酶把这些切口连接在一起形成一条完整的DNA链。RNaseH法优于S1核酸酶法，它能获得包括mRNA5'端全部或绝大部分的更长顺序cDNA分子。3）将cDNA重组到载体上合成的cDNA与载体DNA进行连接一般有3种方法：①借助于末端转移酶的3'-OH端合成均聚物的能力，双链cDNA和线性化载体DNA的3'-OH端分别加上均聚核苷酸链；②双链cDNA和线性化载体DNA分别用Klenow片段进行末端补平，然后用T4DNA连接酶进行齐头连接，形成重组体；③通过粘性末端连接。4）.转化重组的载体DNA分子在一定条件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。当不同重组的DNA含有不同的cDNA基因时，整个转化子含有来自mRNA群体的各种cDNA基因，这样的转化子群体构成该mRNA全部遗传信息的cDNA基因文库。5）.目的cDNA克隆的鉴定用于从cDNA文库中筛选和鉴定目的cDNA的方法主要有3种：①核酸杂交②免疫学杂交检测③cDNA同胞选择