目前多肽的研究热点？

度狗不让申诉 2014-12-10 20:05:28 377 浏览

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gukjimf22390 2014-12-11 00:00:00

KJ肽的生物学作用近年来，KJ肽(Antibacterial Peptides) 因其独特的生物活性以及不同于传统抗生素的特殊作用机理，已引起人们极大的研究兴趣，这些肽类KJ物质显示了在医学和农业上潜在的研究和应用价值。KJ肽是生物体产生的一种具有KJ活性的多肽，多数KJ肽具有分子小、带正电、两亲性、广谱KJ等共同特点，它们在宿主先天性免疫和适应性免疫中有重要作用。根据结构和三维构象的差异，KJ肽包括以下四类。⑴：具有α螺旋结构的线性肽，如蜂毒肽、蛙皮肽等；⑵：含有二硫键的β折叠结构，如防御肽、昆虫防御肽等；⑶：由一种或多种氨基酸为主构成的多肽，如PR239、Drosocin等；⑷：具有环形结构的多肽，如Bactenecin、Ranalexin等。目前，比较清楚的是昆虫KJ肽的作用机制，主要包括细胞膜电势依赖通道的形成，YZ细胞呼吸，YZ细胞外膜蛋白的合成以及YZ细胞壁的形成。Okada等发现，KJ肽使细胞内的K+快速被析出，ATP含量迅速下降，继而导致细胞死亡。Cociancich等发现，孔道的形成、开启和关闭都依赖于膜的电势。离子通道形成可分为3个步骤，即(1)：KJ肽通过静电作用被吸附到膜表面；(2)：KJ肽的疏水尾巴插入细胞膜；(3)：KJ肽的两性分子α2螺旋插入膜内，多个KJ肽共同作用形成离子通道。Thanatin则主要是通过YZ细胞的呼吸作用来杀菌的。Carlsson等研究发现，Attacin可干扰大肠杆菌细胞外膜蛋白Omp C，Omp F，Omp A以及Lam B基因的转录，使这些蛋白质含量减少，导致细胞膜的通透性增加，YZ细菌生长。Sarcotoxins II可YZ细菌细胞壁形成，使细菌不能维持正常的细胞形态而生长受阻。 KJ肽与传统的抗生素有很大的不同：(1)产生机制不同：抗生素主要是细菌发酵产物，由酶促反应合成，KJ肽是由宿主基因编码在核糖体上合成的产物。(2)杀菌机制不同：抗生素多数通过YZ细菌细胞壁或DNA合成发挥作用，KJ肽通过与带负电的微生物细胞膜直接作用，改变其通透性，造成膜的物理性损伤，导致细胞内容物外渗而死亡。(3)作用方式不同：抗生素作用涉及到和细菌胞膜上或胞内特异的受体结合，且受体类型有限，细菌易产生耐药性，KJ肽作用是阴阳离子的物理作用，不产生抗性。 KJ肽具有广阔的应用前景，它是哺乳动物防御系统的重要组成部分，具有热稳定、水溶性好、广谱杀菌甚至有的能杀真菌、原虫等优点，且对较大的离子强度和较低或较高的pH都有较强的抗性，而对真核细胞几乎无作用，仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞，并且与抗生素通过阻断大分子生物合成的作用机制完全不同，病源菌不易对其产生耐药性，由此显示了它具有独特的研究和应用价值。近20年来，人们对KJ肽已进行了比较系统的理论和应用研究，显示了它具有以下几个方面在畜牧生产上的研究和应用前景。 ⑴YY前景随着对KJ肽结构与活性的关系、KJ肽作用机制及其基因表达调控机理认识的不断深化，设计一种GX的、利于人类健康的KJ肽作抗生素替代品是完全可行的。 ⑵转基因研究及应用借鉴已成功的昆虫KJ肽转基因工程，如转基因蚊子、转基因水稻等，把特异的KJ肽基因转入畜禽特定细胞使其表达，从而产生抗病新品种，不失为一条发展畜牧生产的新思路，前景深远。 ⑶KJ肽基因表达调控及KJ肽添加剂研究用基因工程方法生产环保型KJ肽添加剂、通过日粮因素调控KJ肽基因的表达而达到畜产品无抗生素化值得进一步研究。由于KJ肽分子小，分离提纯存在一定的困难，故天然资源有限。化学合成和基因工程法获得KJ肽是主要手段，但化学合成KJ肽成本高，而通过基因工程在微生物中直接表达KJ肽基因，则可能对宿主有害而不能获取表达产物。所以，对KJ肽的结构、构效关系及作用机理还需进一步研究。

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前言

许多发光材料的发光特性随温度、压力或化学物质的存在而变化。这种特性在发光传感器的开发中得到了长期的应用。除了化学传感外，发光测温法也是最常用的传感方法之一。与其他方法不同，它不需要宏观的探针与探测区域进行物理接触。这是发光测温法无可比拟的优势。例如，可以功能化的发光纳米颗粒进入生物靶，荧光显微镜可以准确探测不同区域的温度。这种纳米测温法在医学领域有很大的潜力，如：对温度高于平均值的癌细胞进行成像[1]。

发光测温可以根据强度、线宽、光致发光寿命或光谱位移的变化来进行。由于镧系离子的稳定性和窄光谱特性，很容易识别到这些变化，因此在温度传感的应用中经常使用镧系离子[2]。此外，镧系掺杂材料呈现上转换发光性质: 可被近红外(NIR)光激发，在光谱可见光区发射。近红外光谱激发减少了生物组织的自吸收和散射，因此远程激励变得更加容易。由于这一性质，越来越多的温度生物成像研究使用无机纳米掺杂镧离子制备上转换纳米颗粒 (UCNPs)[3]。

图1. NaY0.77Yb0.20Er0.03F4上转换发光机理的结构示意图，其中红色和绿色的线代表发射跃迁。灰色的线代表非辐射跃迁。

图1是上转换荧光粉NaY0.77Yb0.20Er0.03F4发光机理的示意图。至少需要两个980nm的光子去激发样品来产生可见区的发射。除了直接激发Er3+离子外，还存在从激发态Yb3+与Er3+激发态的能量转移，该材料在可见光光谱的蓝色、绿色和红色区域发光。取决于跃迁过程中Er3+能级的高低。上转换的测温法通常集中使用525nm和540nm两个波长的发射峰，分别对应2H11/2 →4I15/2和4S3/2 → 4I15/2能级跃迁。2H11/2和2H11/2两个能级在能量上紧密间隔，他们实际处于热平衡状态。因此，它们的粒子数比例可以用玻尔兹曼分布来表示:

式中，Ni是能级i上的粒子数，Δe是两个能级间的能量差，k是玻尔兹曼常数，C是简并常数。

基于此，525nm与540nm处荧光强度的比值RHS可用来推出2H11/2与4S3/2的比值，从而能够计算出样品的温度。爱丁堡(Edinburgh Instruments）荧光光谱仪FLS1000通过光纤耦合变温台能够完成该测试项目。此变温台不仅能够保证在FLS1000和显微镜下研究的为同一样品，并且没有任何中间样品转移步骤。本文通过FLS1000荧光光谱仪耦合变温台对上转换样品NaY0.77Yb0.20Er0.03F4进行不同温度下上转换发光的测试。

测试方法与样品

测试样品为NaY0.77Yb0.20Er0.03F4上转换发光粉末，购置于Sigma Aldrich。将样品放置于Linkam HFS350EV-PB4冷热台里的石英样品池中。通过光纤将冷热台与FLS1000样品仓相连接。使用稳态光源Xe2 980nm进行激发，激光能量要低，以防止样品变热。使用980nm的激光器往往会造成样品受激光照射而变热[4]。FLS1000配置：双单色器，标准检测器PMT-900。时间分辨的寿命测试使用脉冲氙灯(μF2)作为激发光源，采用MCS模式测试发光寿命。

测试结果与讨论

使用FLS1000的Fluoracle中温度mapping的测试功能，分别测试从-100℃到80℃每间隔20℃温度范围内，样品上转换发射的红光及绿光随温度的变化情况。结果如图2（上转化绿光）和3（上转换红光）所示。图2 中上转换绿光发射峰是由于Er3+的2H11/2 →4I15/2和4S3/2 → 4I15/2两个能级跃迁产生的。4S3/2 → 4I15/2和4F9/2 → 4I15/2对应发射峰的强度随着温度升高而降低。但是2H11/2 → 4I15/2对应的谱待变化的稍有不同：在273K以下，随着温度的增加其发光强度降低。但当温度继续升高时，增长缓慢。

图2. NaY0.77Yb0.20Er0.03F4温度相关的发射图谱（绿光部分）。使用耦合Linkam冷热台的FLS1000光谱仪进行测试。测试条件：λex=980 nm, Δλex=10 nm, Δλem=10 nm, 步进step=0.10nm, 积分时间=1s/step。内插图为对应2H11/2→ 4I15/2跃迁的发射范围的放大图。

图3. NaY0.77Yb0.20Er0.03F4温度相关的发射图谱（红光部分）。使用耦合Linkam冷热台的FLS1000光谱仪进行测试。测试条件：λex=980nm, Δλex=10nm, Δλem=10nm, 步进step=0.10nm, 积分时间=1s/step。

图4. NaY0.77Yb0.20Er0.03F4温度相关的寿命三维谱图。使用耦合Linkam冷热台的FLS1000光谱仪进行测试。测试2H11/2→ 4I15/2对应的发射。测试条件：λex=980nm, Δλex=15nm, λem=541nm ，Δλem=10nm, 灯源频率=100Hz, 采集时间：每条衰退曲线采集5分钟。红色和蓝色曲线分别代表-100℃和40℃下的测试结果。随着温度的增加，非辐射弛豫过程降低了整体的上转换发光过程。有关温度的猝灭的动力学可以通过图4所示的温度相关的三维寿命谱图来进行研究，当温度增加时，该样品的发光寿命从640μs降低至530μs，有明显下降。回到图2和图3，从4S3/2 ，2H11/2 到4F9/2的弛豫过程相对增加了红色光的发射强度。这可以从图5（a）的温度Rrg函数看出。2H11/2 →4I15/2和4S3/2 → 4I15/2的比值，RHS是优异的温度指数参数(前言已介绍过)，图5（b）是RHS随温度的变化图，图5（c）是相同数据的对数值。有趣的是，RHS并没有遵循玻尔兹曼曲线：在高温下，额外的弛豫过程发生并引发4S3/2 → 4I15/2跃迁的“缓慢增加”。这与之前的报告一致[5,6]，证明了上转换的复杂动力学过程: 4H11/2到 4S3/2的非辐射过程在高温下变得更为重要，所以粒子数与RHS不相等。应该指出不同温度下的RHS 很大程度上取决于样品颗粒的大小[4,6]。为了说明上转换测温的概念，将曲线的低温区域拟合到图5 (c)所示的直线玻尔兹曼图中，可以得到荧光测温系统S的相对灵敏度。这是评价发光温度计系统的一个有用参数，计算方法如下:

图5的斜率为-ΔE/k, 在20℃的灵敏度为1.0%K-1。这一结果与类似的上转换测温系统是一致的。

图5. 上转换发射带强度的比值随温度变化的函数图：（a）红光和绿光的比值（b）2H11/2 →4I15/2和4S3/2 → 4I15/2的比值 (c) 图(b)的对数数据图。与玻尔兹曼图第一部分的线性拟合如(c)所示。

结论

NaY0.77Yb0.20Er0.03F4温度相关上转换发光强度及寿命均可使用爱丁堡荧光光谱仪FLS1000 耦合Linkam冷热台进行测试。2H11/2 →4I15/2和4S3/2 → 4I15/2的比值可作为发光测温系统中的温度探针，其灵敏度为1.0%K-1。通过光纤耦合的Linkam冷热台附件能够使用户在发光测试和显微镜下灵活轻松切换，中途不需要样品转移步骤。

参考文献

[1] C. D. S. Brites, et al., Nanoscale 4, 4799-4829 (2012)
[2] M. D. Dramianin, Methods Appl. Fluoresc. 4, 042001 (2016)
[3] M. González-Béjar and J. Pérez-Prieto, Methods Appl. Fluoresc. 3, 042002 (2015)
[4] S. Zhou, et al., Optics Communications 291, 138-142 (2013)
[5] X. Bai, et al., J. Phys. Chem. C 111, 13611-13617 (2007)
[6] W. Yu, et al., Dalton Trans. 43, 6139-6147 (2014)

2022-12-27 15:23:37 290 0