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分析多肽E和多肽F得到以下结果---这个题目具体怎样解答呢?

風越尤娜 2014-09-11 00:49:06 485  浏览
  • 分析多肽E和多肽F得到以下结果(单位:个):txjy 元素或基团 C H O N 氨基 羧基 多肽E 201 348 62 55 3 2 多肽F 182 294 55 60 6 1 两种多肽中氨基酸的数目Z可能是 选项 A B C D 多肽E 199 340 58 53 多肽F 18... 分析多肽E和多肽F得到以下结果(单位:个):txjy 元素或基团 C H O N 氨基 羧基 多肽E 201 348 62 55 3 2 多肽F 182 294 55 60 6 1 两种多肽中氨基酸的数目Z可能是 选项 A B C D 多肽E 199 340 58 53 多肽F 181 281 53 55 我在网上看到很多人给出了解答,他们都是以N及氨基数量计算的,但是,我看明白~为什么不能按羧基计算呢?对E因为有两个羧基,那根据多肽链的理解,氨基酸个数+1+2(R上氧的个数)=62那氨基酸个数应该是59啊,同理对F应该是55-1=54才对啊,请各位大师指点下--非常感谢~~~~ 展开

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  • 意犹未尽lele 2014-09-12 00:00:00
    这道题很简单,选择题,又是Z可能是数目,所以初略推测即可。C、H显然不适合作为推测对象。n个氨基酸形成一条肽链后肽键中含n-1个O和N,氨基端有1个N,羧基端有2个O,所以,有几个N只能有小于等于几个N的氨基酸(考虑到碱性氨基酸残基上的N),有几个C只能有小于等于减一个O(考虑到含羟基的氨基酸和酸性氨基酸)的氨基酸。 多肽E因为有55个N,氨基酸数目一定小于等于55;多肽F因为有55个氧,所以其氨基酸数目一定小于或等于54。答案只能选D,但D的多肽F是55,那这个肽是环肽就没有问题了!所以,D是Z可能的答案,究竟是不是,还需要进一步验证,但ABC是绝无可能的。 由于肽上氨基酸残基本身结构的多样性,既不能只考虑N,也不能只考虑O,作为粗判,必以少的那个考虑,你说对吗?

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分析多肽E和多肽F得到以下结果---这个题目具体怎样解答呢?
分析多肽E和多肽F得到以下结果(单位:个):txjy 元素或基团 C H O N 氨基 羧基 多肽E 201 348 62 55 3 2 多肽F 182 294 55 60 6 1 两种多肽中氨基酸的数目Z可能是 选项 A B C D 多肽E 199 340 58 53 多肽F 18... 分析多肽E和多肽F得到以下结果(单位:个):txjy 元素或基团 C H O N 氨基 羧基 多肽E 201 348 62 55 3 2 多肽F 182 294 55 60 6 1 两种多肽中氨基酸的数目Z可能是 选项 A B C D 多肽E 199 340 58 53 多肽F 181 281 53 55 我在网上看到很多人给出了解答,他们都是以N及氨基数量计算的,但是,我看明白~为什么不能按羧基计算呢?对E因为有两个羧基,那根据多肽链的理解,氨基酸个数+1+2(R上氧的个数)=62那氨基酸个数应该是59啊,同理对F应该是55-1=54才对啊,请各位大师指点下--非常感谢~~~~ 展开
2014-09-11 00:49:06 485 1
分析多肽E和多肽F,得到以下结果
元素∶C H O N 氨基 羧基 多肽E∶201 348 62 53 3 2 多肽F∶182 294 55 54 6 1 多肽E和多肽F中氨基酸的数目Z可能是多少? 答案是51和49。 如果这是环状的答案,可不可以等于,50和48。
2015-10-04 10:45:33 343 1
分析多肽E和多肽F得到以下结果(……但是答案还+1,请问为什么??)
元素或基团 C H 0 N 氨基 羧基 多肽E 201 348 62 53 3 2 多肽F 182 294 45 54 6 l 多肽E和多肽F中氨基酸的数目Z可能是( ) A、199和181 B、340和281 C、58和53 D、51和49 我是... 元素或基团 C H 0 N 氨基 羧基 多肽E 201 348 62 53 3 2 多肽F 182 294 45 54 6 l 多肽E和多肽F中氨基酸的数目Z可能是( ) A、199和181 B、340和281 C、58和53 D、51和49 我是这样理解的,每个氨基酸里面有含有N, 这个N存在于氨基或R基里面。每隔氨基里都只含有1个N,则其余的必定在R基里面。 我只要求出R基就能求出氨基酸的个数了。 所以我用N=53 - 3个氨基数,不就等于50个R基。(即50个氨基酸了吗?) ……但是答案还+1,请问为什么?? 展开
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蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南一

引言

反相HPLC已成为分离和分析蛋白质和多肽的重要工具。

它在生物技术行业中被广泛应用于蛋白质类ZL产品的表征,以及这些产品和杂质的鉴定。

在通过质谱鉴定蛋白质之前,反相HPLC在从消化后的蛋白质组中分离多肽方面有着至关重要的作用。

它也被用于探索性研究中多种蛋白质和多肽的纯化,以及蛋白类ZL药物的大规模纯化。


反相HPLC灵敏、通用性强,还可与质谱等技术结合使用,在蛋白质研究中具有重要的地位。

此外,它还能够分离结构近乎相同的蛋白质,因而得到了广泛的应用。

正如牛、人和猪胰岛素变异体的分离过程所示(图1),反相HPLC能够分离非常相似的蛋白质。

牛胰岛素和人胰岛素仅有三个氨基酸的差别,也能够被完全分离开来。

牛胰岛素在胰岛素a链的第8位为丙氨酸,第10位为缬氨酸,b链的第30位为丙氨酸。

而人胰岛素在胰岛素a链的第8位为苏氨酸,第10位为异亮氨酸,b链的第30位为苏氨酸。


1. RP-HPLC对紧密关联的胰岛素变异体进行分离


条件  

色谱柱:ACE 5 C18,4.6 x 250mm  

洗脱液:含有29.3 - 31.7% 乙腈的 0.1% 三氟乙酸溶液,以1.0毫升/分钟的速率洗脱至少16分钟  

样品:牛、人和猪胰岛素  


 

 


 
 

猪胰岛素和人胰岛素仅有一个氨基酸的差异(猪胰岛素的b链第30位为丙氨酸,人胰岛素该位置为苏氨酸),在基线即已分离。  

在另一个实例中,尽管兔胰岛素和人胰岛素仅有一个氨基酸的差异,即以苏氨酸取代了丝氨酸,但也同样得到了分离(参考文献1)。  


 

反相HPLC的高分离能力也被扩展应用到了多肽上。  

在图2中,两种多肽尽管只有一个氨基酸的差异,即丝氨酸对苏氨酸,但也得到了完全的分离。  

这种高分离能力是反相HPLC在蛋白质和多肽分离中得到广泛应用的基础性因素。  

 

2. RP-HPLC对紧密关联的多肽进行分离。仅有一个氨基酸不同的两种十肽菌素,一种含丝氨酸,而另一种含苏氨酸  

条件  

 

色谱柱:C18 宽孔柱, 4.6 x 250 毫米  

 

洗脱液:  

 

A. 含有0.1%三氟乙酸的水溶液  

 

B. 含有0.08%三氟乙酸的乙腈溶液  

 

梯度:0 - 35%B溶液超过73分钟(参考文献2  



蛋白质/多肽的保留机制  

在反相HPLC中,颗粒表面是十分疏水的,因为其表面通过化学连接有羟基(图3中的波浪形红线)。  

通过疏水表面对蛋白质一面(被称为疏水性足)的吸附,蛋白质被保留下来(图3)。  

与疏水表面的厚度相比,蛋白质要大得多,因此蛋白质仅有一部分被疏水表面所吸附。  

大部分蛋白质位于表面上方并与流动相接触。  

由这种疏水性吸附所导致的净相互作用非常强,会导致蛋白质保持吸附在表面上(图4A),直至接触到特定浓度的有机溶剂,这时蛋白质会从表面上解吸附并从色谱柱上洗脱(图4B)。  

在Z初的吸附/解吸附之后,尽管蛋白质在从色谱柱上移动下来时仍会与表面产生一些相互作用,但却是十分微弱的,对分离过程无影响。  

分离是由单次吸附/解吸附过程完成的。  

解吸蛋白质所需要的有机改性剂的浓度十分精确,并与疏水足的大小呈函数关系。  

详情请参阅参考文献3  


 

4. 进入色谱柱的蛋白质被吸附在柱顶端附近的疏水表面上(A)并且一直保持吸附,直至有机改性剂的浓度达到特定值,此时蛋白质从表面解吸附(B)。  

 


 

反相HPLC中,吸附/解吸保留机制导致蛋白质的保留行为与小分子不同。  

小分子的保留行为随着有机溶剂浓度的改变而缓慢改变时(图5,联苯),一旦有机溶剂的浓度达到所需要的值,蛋白质的保留行为即发生突然改变,引起保留时间的快速变化(图5,蛋白质)。  

该过程产生的尖锐峰形常见于蛋白质和多肽(图6A)。  

由于有机溶剂浓度的微小变化会引起的显著的保留行为变化,等度洗脱很少被用于蛋白质中,因为峰变宽了,而有机溶剂的微小改变会导致蛋白质保留行为的巨大变化(图6B)。

5.有机溶剂浓度对应的保留行为
 

 


 

6.  

A. 梯度洗脱过程中多肽和蛋白质洗脱出尖锐峰形。  

B. 等度洗脱下,蛋白质的峰形(本例中为溶菌酶)很宽,有机溶剂的微小改变都会引起保留时间的巨大变化。  

 

 



 

2019-06-12 13:27:41 452 0
蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南三

蛋白质/多肽液相分析中的流动相选择

有机溶剂可将吸附在疏水界面的蛋白质洗脱(图14)。

在梯度洗脱期间,当有机溶剂量达到针对每一蛋白质的特定浓度时,蛋白质就会从疏水界面上解吸,继续顺着柱向下,从而从柱中洗脱。

14. 当有机改性剂的浓度达到特定值时,蛋白质从疏水界面洗脱。


乙腈。在多肽的反相色谱分离时Z常用的有机溶剂为乙腈。为什么选择乙腈?

  • 乙腈易挥发,易从样品中去除。

  • 乙腈黏度低,柱压低。

  • 乙腈的紫外吸收截止波长较短。

  • 乙腈长期用于分离应用。


异丙醇。异丙醇在多肽的色谱分离中具有重要作用。尽管异丙醇黏度大(会增大柱压),很少单独用作有机改性剂,但其在提高一些多肽的回收率方面具有重要作用,尤其是强疏水性蛋白。
在此类情况下,以
1%~5%的恒定浓度加入异丙醇,以提高疏水性多肽的回收率或洗脱。

其它有机改性剂。很少使用甲醇或乙醇等有机改性剂,除非在分离强疏水性蛋白时。此外,由于乙醇毒性低,因此还用于蛋白质的大规模纯化。

 


梯度洗脱。多肽的洗脱几乎都采用梯度洗脱法,采用梯度洗脱法分离时,逐渐增大有机溶剂的相对浓度。
当有机改性剂的浓度升到解吸所需的特定浓度时,蛋白质和多肽就从柱上洗脱。如图
15所示,有机改性剂的浓度(梯度)变化速率越慢,这些蛋白亚基的分辨率越高。
在该例中,相较于每分钟
0.5%的梯度变化速率,每分钟0.25%的梯度变化显着提高了分辨率。
蛋白质/多肽的保留机制的图1中显示了采用每分钟0.15%的梯度变化速率时几种胰岛素的分离过程。采用每分钟0.05%的梯度变化速率洗脱时,分辨率Z大。

15. 一般情况下,降低有机溶剂浓度变化速率会提高分辨率。

A.   细胞色素c亚基

B.   色谱图A中间片段的重现。

色谱柱:C4 宽孔柱, 4.6 x 250 毫米



降低梯度变化速率增加分辨率时,所需的分析时间必须尽可能短。
但是,梯度变化速率的调整在优化蛋白质和多肽的分辨率方面非常重要。

有时,降低梯度变化速率时,多肽会表现出特异行为(图16)。
分辨率有时不会按照预期增加,反而会降低,导致出现共洗脱,甚至洗脱顺序也会颠倒。
在图
16的示例中,洗脱时间为45分钟时多肽1112表现出Z佳的分离效果。
当洗脱时间增加至
90分钟时,多肽1112间的分辨率降低;而当洗脱时间增加至160分钟时,出现共洗脱峰。
这种保留行为是多肽表面相互作用的结果,导致这种行为的原因目前尚不清楚。
因此,在进行多肽分离时,尤其是在分离蛋白酶水解物时,观察分辨率随梯度坡度降低的变化很重要。
如果分辨率未增加,反而降低,则必须优化梯度变化速率,以Z大化整体分辨率。

16. 多肽间分辨率有时随着溶剂浓度变化速率的降低(洗脱时间增加)而降低。
这将导致分辨率降低或共洗脱峰的出现,如人生长激素肽图中多肽
1112例示。
在一些情况下,多肽甚至会逆转洗脱顺序。

 

样品人生长激素的胰蛋白酶水解物。部分显示了多肽图谱。



色谱柱:C18宽孔柱,4.6 x 150 mm

洗脱液:梯度:0~60%乙腈与水溶性溶剂和0.1%TFA混合液和有机溶剂与0.08%TFA混合液在一定时间内形成梯度洗脱。

 


蛋白质和多肽的反相色谱分析法需要离子对试剂
在流动相中加入离子对试剂,以实现良好的峰形。
目前认为,在没有离子对试剂的情况下,硅胶表面的金属杂质是导致蛋白质
/多肽峰形较差的原因。

 


 

 

三氟乙酸。三氟乙酸(TFA)是Z常用的离子对试剂。将浓度为~0.1%的三氟乙酸加入流动相,会在大多数柱上产生良好的峰形(图17)。
降低
TFA的浓度能提高LC-MS的检测灵敏度(见22~25页),但由于硅胶表面存在杂质,可能会导致硅胶柱上的峰形较差。
但采用高纯度硅胶柱时,可加入低浓度
TFA(图17A——0.01% TFA)。


17. TFA浓度对峰形和选择性的影响


 

洗脱液:加入如图所示的TFA,以20%~32%的乙腈(ACN)梯度洗脱,洗脱时间为15分钟。
样品1.血管紧张素II 2.血管紧张素III3.血管紧张素I


 

其它离子对试剂。尽管目前为止TFA仍是Z常用的离子对试剂,但蛋白质/多肽分离有时会采用磷酸和七氟丁酸(HFBA)等其它试剂。

 

如图18所示,一些情况下,磷酸可分离一些TFA无法分离的多肽。通常磷酸盐使用浓度约为20-30 mMpH2~2.5。此外,磷酸盐缓冲液对一些蛋白质的分离效果要优于TFA
尽管同
TFA一样,磷酸盐缓冲液使用的pH通常较低,但磷酸盐缓冲液也能适应较高的pH,为选择性和分辨率的改变提供了机会(见17页)。
将磷酸盐作为离子对试剂的主要弊端是:磷酸盐不挥发,很难从肽中去除。

 

一些时候,七氟丁酸用作组蛋白等碱性蛋白分离的离子对试剂


 

18. 使用除TFA以外的离子对试剂可能会产生不同的选择性



条件
色谱柱:C18 宽孔柱, 4.6 x 250 毫米

洗脱液:
A.4%~40% 乙腈—0.1%TFA体系,pH=2,18分钟梯度洗脱。
B.4%~40% 乙腈—20mM 磷酸体系,pH=2,18分钟梯度洗脱。
样品:

  1. 缓激肽

  2. 神经降压素

  3. 蛙皮素

  4. 章鱼唾腺精


pH值对多肽保留行为的影响。不论采用TFA和磷酸,还是其它离子对试剂,用于多肽分离的反相流动相通常适应的pH值较低。
在低
pH值条件下,羧酸基团——端羧基,以及天冬氨酸和谷氨酸的侧链会进行质子化,且仅有轻微极性。
将流动相的
pH值增加至6~7将会使羧酸基团离子化,减弱多肽的疏水性。这将降低各种多肽的保留值,但尤其影响含天冬氨酸或谷氨酸的多肽(图19)。
与其它多肽相比,含天冬氨酸和谷氨酸的多肽的保留值降低更多,从而改变了选择性。尽管增加多肽分离流动相
pH的做法不经常采用,但它可以在一些特定情况下发挥作用


 

 

19. 流动相的pH值会影响多肽的保留值,尤其是含酸性氨基酸残基(天冬氨酸和谷氨酸)的多肽。


条件
谱柱:ACE 5 C18-3004.6 x 250 mm
洗脱液:
A.20%~32% 乙腈—0.1%TFA体系,pH=2,15分钟梯度洗脱。
B.20%~32% 乙腈—10mM NH4OAc体系,pH=7,15分钟梯度洗脱。
样品

  1. 血管紧张素II

  2. 血管紧张素III

  3. 血管紧张素I


流速。流动相的流速对反相GX液相色谱法分离的分辨率影响不大。
如图20所示,流动相流速为0.5、1.0或2.0 ml/min时,胰蛋白酶图谱中多肽的分辨率大致相同。
但梯度体积必须恒定才能维持分辨率一致。
这需要随着流速的增加减少梯度洗脱时间。
体系压力随着流速的增加而增加;体系压力可能会限制可用的流速。
此外,较高的流速还会使检测灵敏度稍有降低,但可能增加大分子蛋白或疏水性蛋白的溶解度。


 

20. 流动相的流速对多肽的分辨率影响不大。随着流速的变化,总梯度体积必须保持恒定才能维持分辨率一致。

 


条件
色谱柱:C18小孔柱,4.6 x 250 mm
洗脱液:10%~50% 乙腈~0.1% TFA 体系,时间、流速如图所示

样品β-乳球蛋白的胰蛋白酶水解物

2019-06-14 14:11:23 549 0

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