细胞冷冻保存的关键要注意的问题是什么？

1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；
3. 离心1000rpm，5min；
4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的Z终密度为5×106/ml～1×107/ml；
5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；
6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/
min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

8．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但Z好为对数生长期细胞。在冻存前一天Z好换一次培养液；
9．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；
10．冻存和复苏Z好用新配制的培养液。