如何正确绘制血清醋酸纤维薄膜电泳图谱

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  QQ477287371 2016-12-01 20:53:12

  人体中含有的各种血清蛋白执行着许多特殊的功能。在各种疾病期间总血清蛋白浓度和各蛋白质组分的比例可发生变化，因此，血清蛋白质和各蛋白质组分的定量在临床诊断和ZL上有很重的价值[1]。“血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳”实验因而是《生物化学》学科实验项目中Z常开设的基本实验项目之一，该实验的开设有利于帮助学生更进一步了解血清蛋白质的基本组分及正常含量。但是，电泳分析由于手工比重较大，技术人员的经验和手法、电泳温度和时间、缓冲液离子度的改变、电泳薄膜的脱色及透明等诸多因素直接影响分析结果的准确性和重复性[2]。要使血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验顺利成功，就必须重视实验的各个环节，尤其在实验仪器、实验药品和载体、实验准备、学生操作等主要环节。经过多年反复实践，笔者认为“血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳”实验要取得成功应注意以下四个主要环节。 1.实验仪器方面应注意： 1.1电泳仪和电泳槽 北京六一仪器厂生产的DYY-Ⅲ8A稳压稳流定时电泳仪、电泳槽。每次试验开始或结束要注意将电泳仪的各个调节枢纽调至零点位置，电泳槽要用水洗净再用蒸馏水冲洗凉干，保护铂金丝，使之不被腐蚀。 1.2分析天平 上海天平仪器厂出产的TG328B分析天平。使用前进行调试，保证测定结果正确。 1.3分光光度仪 上海第三分析仪器厂制造的721分光光度计。使用前进行调试，保证称量数量准确。 2.实验药品和载体方面应注意： 2.1实验药品 用于配制缓冲液及染色液所用的药品，尽可能选择正规厂家生产的药品，试剂等级要求在AR或以上，而且要求配制缓冲液所需的和钠，两种药品尽可能为同一厂家生产，并注意有效期。 2.2载体 由于载体成分及做工不同，对血清蛋白吸附、分离等能力不同会造成电泳结果的差异[3]。因此，血清蛋白电泳所选用的载体-醋酸纤维素薄膜（我们选用浙江黄岩四青生化材料厂出品）的质量要求应该是质细、孔细、吸水性强、染料吸附量少、蛋白区带分离鲜明、对蛋白染色稳定者为佳。 3.试验准备时需注意： 3.1试剂准备 配制缓冲液的药品（缓冲液-/钠，PH8.6、离子强度0.06）要求用分析天平称量，Z好精确到0.001g。配制的缓冲液离子强度偏小易导致区带拖尾；若缓冲液离子强度偏大易导致区带过密。配制染色液的药品（氨基黑10B）也用分析天平称量，Z好精确到0.01g。其它试剂可按照常规配制。 3.2电泳仪和电泳槽准备及电极的连接 3.2.1电泳仪的准备 首先检查电泳仪功能状态，将各个调节枢纽调至零点位置，使指针复位。 3.2.2电泳槽准备的准备 首先要用水洗净电泳槽，再用蒸馏水冲洗电泳槽后凉干，把洗净并折叠好的四层干沙布放在装有缓冲液的玻璃槽中浸泡，再置于电泳槽中的支架上搭桥，然后向两边的电泳槽中加入等体积的缓冲液至刻度线水平。 3.2.3电极的连接 Z初两次电泳可按照“正常连接方式”将电泳仪上的电极连接于电泳槽的电极上。如果连续多次电泳则需要“调换电极连接方式”才能获得理想的电泳效果，否则要求更换电泳槽中的缓冲液。 4.学生操作时必须注意： 实验过程中正确指导学生操作是做好本试验的主要环节，必须加强对学生在准备、点样、电泳、通电、染色和漂洗、定量等步骤的指导，持别是在“点样”这一步骤。 4.1准备 将醋酸纤维素薄膜切割成2×8cm的矩形小孩子条，在其粗糙面的一端1.5cm处，用铅笔轻划一横线作为“加样位置”的记号，可以按照每位同学的学号进行编号，然后置于装有缓冲液的玻璃槽中浸泡并不断摇动5～10分钟，待薄膜充分浸透后，即膜条无白斑时，用摄子取出，夹于洁净的滤纸中间吸去多余的缓冲液。注意不能吸得太干以避免影响导电，点样薄膜过干，导致电泳图谱有条痕，亦不能留存过多缓冲液以避免点样时血清随着缓冲液而扩散开来。 4.2点样 掌握好点样技术是获得清晰电泳图谱的Z重要环节。先取少量血清置于玻璃板上，用点样器（盖铝片制作）的钢口蘸取血清，然后将钢口平值“印”于点样线上（不可用力过大以避免弄破薄膜），待血清渗入薄膜后移开点样器。注意观查血清是否均匀地分布在点样线上，若有血清扩散或血清分布不均匀则废弃，重新选用另外一张准备好（指已浸泡透）的备用薄膜点样。 必须注意的是：点样时血清分布不均匀易导致电泳图谱不齐；点样时血清加样量过多易导致电泳图谱分离不良或中间颜色变浅；点样时血清加样量过少可导致电泳图谱染色过浅。这些因素会影响蛋白电泳的结果分析。因此，在实验操作时应指导学生掌握好加样量，以避免造成定量测定时产生结果误差。 4.3电泳 将已点样的薄膜端靠近阴极，粗糙面（即点样面）向下（防蒸干影响导电）平整地紧贴于电泳槽支架的“沙布桥”上。盖上盖子，平衡5分钟后通电。注意，电泳槽密闭不严，薄膜易蒸干，导致电泳图谱有条痕。 4.4通电 一般用电压130～160Ⅴ，若用电流则按照0.4～0.6毫安/厘米进 行换算。夏季通电40～50分钟，冬季通电60分钟左右。待电泳区带展开约3.5厘米时，将调节枢纽调至零点位置，然后切断电源。如出现电渗现象可增大电流量克服。但是，电流过大易导致电泳图谱有条痕。 4.5染色漂洗 小心从电泳槽中取出薄膜，直接浸于装置染色液的玻璃槽中，并轻轻不断摇动5分钟，待能看清楚蓝色的电泳区带后，取出并用漂洗液连续漂洗，直至薄膜底色漂净为止。即得五条蛋白色带。从远离点样端起依次为清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白。应注意的是染色时间不足够易导致染色后清蛋白中间颜色变浅。 4.6定量 将漂净的薄膜用滤纸吸干，由蛋白质区带分段剪下，分别浸入装有0.4mol/LnaOH溶液的试管中，清蛋白管用4ml，其余各管为2ml。振摇数次，约25分钟，蓝色即可完全浸出。用721分光光度计于580～620nm波长进行比色，蒸馏水调零，读取各管吸光度数，计算出白蛋白和各种球蛋白所占百分比。 4.7透明 如果需要保存电泳结果，可按照下列方法将薄膜透明：将染色、漂洗、干燥后(可用干燥箱干燥)的醋酸纤维素薄膜电泳图谱置于透明液中浸泡1～3分钟后取出，贴于玻璃板上，不要存在气泡。约2～3分钟薄膜便可完全透明，待干后撕下压平整，可供长期保存和直接用于光密度计扫描分析。

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