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sds-page电泳能检测蛋白的纯度吗

15190878283 2018-04-01
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饭桶877
(以下方法仅供参考)
溶液配制
1 Tricine凝胶buffer
称取SDS 0.3g,Tris 36.5g,用浓盐酸调pH至8.45,定容至100mL。4℃保存,1个月内使用。
2 5M HCL
浓盐酸稀释2.4倍,室温保存,1个月内使用。
3 49.5% Arc/Bis,3%C凝胶贮液
称取48g丙烯酰胺,1.5g甲叉双丙烯酰胺,蒸馏水溶解并定容至100mL。4℃保存,1个月内使用。
4 50%甘油
取50mL甘油,加蒸馏水至100mL。室温保存,1个月内使用。
5 10%过硫酸铵溶液
称取过硫酸铵10g,蒸馏水溶解并定容至100mL,分装成1.2mL/支。-20℃保存,一年内使用。
6 正极缓冲液
称取 Tris 24g,用800mL蒸馏水溶解,1M HCL调pH至8.9,定容至1L。4℃保存,一个月内使用。
7 负极缓冲液
称取Tris 12.1g,Tricine 17.9g,SDS 1g,加水溶解,定容至1L。2-8℃保存,半个月内使用。
8 非还原型样品缓冲液(2×)
量取100mM Tris-cl 1mL、溴酚兰20mg、十二烷基硫酸钠0.4g、甘油2mL,加蒸馏水溶解并稀释至10mL,冷冻保存,一年内使用。
9 考马斯亮兰染色液
称取考马斯亮兰R-250 0.25g,加入甲醇45mL、冰醋酸10mL、蒸馏水45mL,混匀即成,室温保存,1个月内使用。
10 脱色液
取甲醇450mL、冰醋酸100mL、注射用水450mL,混匀,室温保存,3个月内使用。

实验流程
1 凝胶模具的组装与检漏
取1.0mm厚度的长短玻璃板,清洗干净后组装模具。注:短板朝里,若只跑一块胶,电泳夹的对面也必须放置一块电泳板。模具组装完成后,沿长短玻璃板之间形成的空隙加入注射用水直至水加满,平放模具。30S后,若液面不下降,则倒掉模具中的水,侧立模具并用滤纸吸干长短玻璃板间的注射用水。若模具漏水,则重新组装模具。
2Tricine SDS-PAGE 凝胶配制
(1)配制下层胶:
16.5%分离胶 10mL
注射用水 0.68mL
Tricine 凝胶Buffer 3.4mL
49.5%Arc/Bis 3%C凝胶储液 3.4mL
50%甘油 2.72mL
TEMED 5μl
10%AP 100μl
(2)配制上层胶:
5%浓缩胶Buffer 6mL
注射用水 3.6mL
Tricine 凝胶Buffer 1.24mL
49.5%Arc/Bis 3%C凝胶储液 0.4mL
TEMED 6μl
10%AP 60μl
先配制下层胶,按下层胶配方依次加入相应溶液后,立即混匀(尤其是加入TEMED和10%AP时动作要快),倒入准备好的凝胶模具中,注意勿打入气泡,高度至槽高2/3-3/4。用移液器在凝胶上方轻轻加入蒸馏水,水封。20min凝胶聚合后,倒掉模具中水封用的蒸馏水,侧立模具,用滤纸吸干模具中的水,但不要接触到下层胶。再配制上层胶,向模具内倒入上层胶至满,插上1.0mm厚度的梳齿。20min凝胶聚合后,拆下模具托盘,将装置放于电泳槽中,向玻璃板之间加入负极液至漫过短板,在外侧尽量多地加入正极液,双手均匀用力拔出梳齿。注:负极液必须漫过短板,正极液加入时不要和负极液相通。
2 电泳
将样品与对照品用注射用水稀释至1mg/mL,取30uL与2×非还原型上样缓冲液30uL以1:1混合,煮沸2min,点样量20μl/孔(双复孔)。
分子量标准65℃预热5min,点样量10μl。恒流35mA,约2-3h结束。
3 染色和脱色
将电泳后的凝胶浸入装有染色液的容器中,于摇床上低速震荡染色约30min,然后更换为脱色液,于摇床上低速震荡脱色至背景全无。

数据处理
用Quantity one 分析软件分析电泳图片,计算出电泳纯度
12 0 2018-04-01 0条评论 回复
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