PCR-DGGE是什么

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  阳光的sadawd 2009-07-26 00:00:00

  聚合酶链式反应和变性梯度凝胶电泳相结合的方法，通常用来分析样品中微生物菌落构成的多样性！

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  姚坤华 2017-09-02 17:02:42

  变性梯度凝胶电泳（Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis， PCR-DGGE）和FISH一样，也是一个常用的分子生物学实验，在环境生物技术领域常用于分析微生物群落的多样性。 DGGE实验的大体操作流程如下： 1. PCR扩增 与普通PCR不同之处是Primer上要加一个GC夹（GC Clamp)，GC夹的序列为：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGC 常用的细菌16S通用引物341fGC/518r的序列如下： 341fGC: 5′-CGCCCGCC GCGCGCGGC GGGCGGGG CGGGGGC ACGGG GGGCCTACG GGAGGC AGCAG-3′ 518r: 5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′ 2.制作凝胶 需要的准备的试剂： (1)新鲜配制的Ammonium Persulfate Solution（APS） 0.1g in 1ml H2O (2)四甲基乙二胺(TEMED) (3)0%和变性剂（的变性剂不容易溶解，可以用80%的来代替），配制方法见Z下面的表格 准备四种不同浓度的凝胶： 顶层胶： 4ml 0%变性剂+4微升TEMED+40微升APS溶液 底层胶： 1ml 80%变性剂+4微升TEMED+40微升APS溶液 如果DGGE需要的变性剂梯度为40%～60%，需要配制40%和60%变性剂凝胶溶液各约13ml： 40%变性剂凝胶溶液：6.5ml 0%变性剂+6.5ml 80%变性剂+13微升TEMED+130微升APS溶液 60%变性剂凝胶溶液：3.25ml 0%变性剂+9.75ml 80%变性剂+13微升TEMED+130微升APS溶液 如需其它梯度，请重新计算。 这几种溶液加在一起后，很快就会凝固，所以混合之前一定要准备好凝胶制作装置。具体制作方法请参考凝胶制作装置的说明书。我们实验室用的是Hofer Gradient Maker，感觉效果还可以。 3. 电泳 将PCR产物和Loading buffer混合后加入胶孔，温度设定为60度，然后开始电泳。不同样品需要的电泳的电压和时间可能不同，需要优化一下，根据我的经验，120V， 6h对很多样品都比较和合适。 4. 染色 用万分之一的EB或SYBR Green I染色， 我比较了一下发现EB效果明显优于SYBR Green I。染色时间5分钟～30分钟都可以，染色时间太长效果并不一定好，我通常染5分钟。 5. 拍照 染色后小心地将凝胶转移到gel documentation system中拍照，要尽快操作，否则在紫外光的作用下，很快图像的效果就会降低。 6. 结果分析 如果需要对DGGE结果进行定量分析，请参考：用Quantity One进行定量分析的方法 需要说明的是，这种定量方法并不是很准，而且因为进行了PCR，定量有很多问题。

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