这个要看是用试剂盒提还是手提。
试剂盒提取的话就很方便很好操作,试剂、吸附柱什么都是商品级的,问题都不大,主要是看你培养的菌质量如何,如果培养菌是挑取的是假阳性或者是培养基抗性出问题,就会因为质粒没有或者量过少而检测不出来,其次的话就是Buffer要加的是无水乙醇,不能加错,其他操作按说明书就没有问题。
手提的话需要质粒提取因素就很多了,这里有总结的很好的你可以看一下:
1、手提中主要是试剂对质粒DNA提取的影响较大,其中溶液Ⅰ,加入的葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,可以YZDNase的活性和微生物生长。此步骤菌体一定要悬浮均匀,不能有结块,否则会降低抽提得率。
2、溶液II中,NaOH是Z佳的溶解细胞的试剂,不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞,碰到了碱后几乎在瞬间就会溶解,这是由于细胞膜发生了从bilaye(双层膜)结构向micelle(微囊)结构的相变化所导致。SDS也呈碱性,但如果只用SDS,达不到彻底溶解细胞的作用,加入SDS主要为下一步做铺垫。这一步操作要注意两点:diyi,时间不能过长,因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂;第二,必须温柔混合,不然基因组DNA也会断裂。
3、对于溶液Ⅲ,SDS在高盐浓度下发生沉淀,同时SDS能与蛋白质结合,平均两个氨基酸上结合一个SDS分子,所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来。溶液中的K+置换了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS,高浓度的盐使沉淀更完全。同时,由于基因组DNA很长,容易被PDS共沉淀。2M的醋酸可以中和NaOH,因为长时间的碱性条件会打断DNA。基因组DNA一旦发生断裂,小于100kb的片断,就不容易与PDS共沉淀。所以碱处理的时间要短,而且不得激烈振荡,否则Z后得到的质粒上会有大量的基因组DNA污染。这一步操作混合均匀后在冰上放置,可以使PDS沉淀更充分。