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做RT-PCR内参的作用是什么?应该如何选择管家基因

mc呀呀呀呀呀 2014-12-08 07:26:32 784  浏览
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全部评论(2条)

  • zxc5200zxc 2014-12-09 00:00:00
    做任何实验都是需要对照的,内参就是一个阳性对照,如果连阳性对照都没有扩出来,说明模版是有问题的,那么你的目的基因肯定是扩不出来的。常用的管家基因就三种:GAPDH、ACTIN、18S RNA。

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  • 深夜孤灯1 2018-04-01 13:56:46
    你说的应该是real time PCR吧,注意RT其实是逆转录reverse transcription的缩写,和real time一定要分开来。 常说的qPCR,qRT-PCR,都是通过实时(real time)的方法,测定样品中某个模版的起始量ct值 但是呢,由于之前RNA提取、反转等步骤,各个步骤存在不同的效率,ct值并无法真实反应样品中模版的量,因此,需要一个内参来做为参考。 比方说,A基因的ct值,在a样品中是18,在b样品中是20,由于a b样品存在RNA质量等等一系列不同,你无法直接就判断这个基因在a样品中的表达量是b样品的4倍。 这时候,我们需要一个内参,假如内参ct值在a样品中是14,而在b样品中是15。由于内参的稳定性,在不同样品中被认为是表达量一致的,因此,A基因的在ab样品之间的-ΔΔct值是1,也就是表达量为2倍的关系。 这里,我们可以知道内参的作用,即通过测量内参,可以在后面分析过程中将不同样品的起始量均一化。内参需要选择在不同样品中有稳定表达量的基因,这就是为什么内参经常选择看家基因的原因。以小鼠为例,常用的内参有actin gapdh hprt等等。 当然,现在的很多观点认为这些基因在不同组织中丰度也不同,例如gapdh,在线粒体含量高的组织中丰度高,很多人认为用基因组DNA做内参会更加靠谱,当然这是后话了,选择gapdh无碍于现阶段的实验,如果觉得不靠谱,可以选择两个内参。 你所研究的物种,应该有人已经发表过相应的内参,直接上数据库搜就可以了。 原创内容,码字不易,万望采纳。

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