t克隆时蓝白斑筛选实验为什么蓝斑做菌落pcr也能扩出来

--蓝白斑筛选过程中，T载体:DNA=1:4，DNA为PCR纯化产物，--如果是摩尔比没什么问题.其实只要目的片段摩尔数高于载体就会有很好的结果.但是如果产物量太大，则会有不良的效果. 根据你的问题 1：检测纯化产物.出了问题后纯化产物一定要走电泳查看，确认回收效率. 2：连接的产物量不用太大.3000bp的T载体如果用25ng，你的643bp产物用10~30ng足够了，这个量在凝胶上只是明确的条带而已， 3：检测感受态：感受态细胞如果是自己做的，也许会有杂菌.买来的也存在一定的几率.做一个空转对照，确认感受态不会有问题. 4：休克温度：42度即可，没必要45度.45秒没问题，实际上30~90秒都可以，我一般用45秒. 5：连接：4度过夜已经足够，除非你的片段很长. 6：蓝白斑筛选：有可能淡蓝色的蓝斑是你需要的克隆，如果你的克隆浅蓝色的斑很多，更可能是这样.一般效率高的话只有少于10%的蓝斑，效率一般则可能超过半数蓝斑甚至更多. 7：生长速度：关于生长速度你的概念是错误的，数百道数千bp的插入克隆生长速度不会差太多，不可以此作为依据.即使你转纯化的质粒克隆也会不一样大小.但是有插入的克隆会略略慢一点点. 8：再确认一下载体吧.