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饲料中黄曲霉，玉米赤霉烯酮和T-2毒素的测定
TC-M160霉菌毒素多功能净化柱
--－LC-MS法
1.使用对象
本方法参考NY/T2071-2011，试样中的*，玉米赤霉烯酮和T-2毒素经乙腈溶液提取，正己烷脱脂及多功能净化柱净化后，氮气吹干，甲酸乙腈溶液溶解，液质法测定。
本方法*与T-2毒素的检测限为1.0ug/kg，定量限为2.0ug/kg；玉米赤霉烯酮的检测限为5.0ug/kg，定量限为10.0ug/kg。
GB13078-2017饲料卫生标准中规定：
黄 曲 霉 毒 素 B1 ug/kg |
饲料 原料 | 种类 | *（ug/kg） | 方法 |
玉米加工产品，花生饼（粕） | ≦50 |
NY/T 2071 | ||
植物油脂（玉米油，花生油除外） | ≦10 | |||
玉米油，花生油 | ≦20 | |||
其他植物性饲料原料 | ≦30 | |||
饲料 产品 | 仔猪，雏禽浓缩饲料 | ≦10 | ||
肉用仔鸭后期，生长鸭，产蛋鸭浓缩饲料 | ≦15 | |||
其他浓缩饲料 | ≦20 | |||
犊牛，羔羊精料补充料 | ≦20 | |||
泌乳期精料补充料 | ≦10 | |||
其他精料补充料 | ≦30 | |||
仔猪，雏禽配合饲料 | ≦10 | |||
肉用仔鸭后期，生长鸭，产蛋鸭配合饲料 | ≦15 | |||
其他配合饲料 | ≦20 |
玉 米 赤 霉 烯 酮 mg/kg |
饲料 原料 | 种类 | *（mg/kg） | 方法 |
玉米及其加工产品(玉米皮，喷浆玉米皮，玉米浆干粉除外) | ≦0.5 |
NY/T 2071 | ||
玉米皮，喷浆玉米皮，玉米浆干粉，玉米酒糟类产品 | ≦1.5 | |||
其他植物性饲料原料 | ≦1 | |||
饲料 产品 | 犊牛，羔羊，泌乳期精料补充料 | ≦0.5 | ||
仔猪配合饲料 | ≦0.15 | |||
青年母猪配合饲料 | ≦0.1 | |||
其他猪配合饲料 | ≦0.25 | |||
其他配合饲料 | ≦0.5 |
T-2 毒 素 mg/kg | 种类 | *（mg/kg） | 方法 |
植物性饲料原料 | ≦0.5 |
NY/T 2071 | |
猪，禽配合饲料 | ≦0.5 |
2.实验准备
2.1溶液配制
甲酸溶液（0.1%）：准确量取甲酸1ml，加水至1000ml，摇匀即得。
乙酸溶液（0.02%）：准确量取冰乙酸0.2ml，加水至1000ml，摇匀即得。
甲酸乙腈溶液：取甲酸溶液50ml，加乙腈至100ml，摇匀即得。
2.2混合标准储备液：
分别吸取一定量的6种真菌毒素标准品于棕色容量瓶中，用甲醇配成浓度为1ug/ml的混合储备液，保存于4℃冰箱中。
2.3基质标准工作液：
分别吸取一定量的真菌毒素标准储备液，添加空白样品提取液，氮气吹干后，用流动相稀释成浓度为1.0ug/L,5.0ug/L,10.0ug/L,50ug/L,100ug/L,200ug/L的混合标准系列工作液，临用新配。
3.样品的前处理
（1）称取5g±0.02g饲料样品于50ml离心管中，准确加入25ml提取液（乙腈：水=84：16），涡旋混匀2min，置于超声波清洗器中超声提取20min，中间振荡2-3次。
（2）取出，于8000r/min离心5min，倾出上清液至分液漏斗中，加入15ml正己烷，充分振荡。待静止分层后，准确量取下层液5ml，待用。
（3）将上述5ml液体，过多功能净化柱，控制流速为2ml/min，收集流出液，在60℃氮气下吹干。
（4）用1.0ml甲酸乙腈溶液溶解残渣，涡旋30s，经0.22um滤膜过滤后，上机检测。
4 液相色谱-串联质谱法
4.1液相色谱条件
色谱柱： C18柱,3.0×150mm（3.0um）；或其他等效色谱柱。
柱温：33℃
进样量：20ul
流动相，流速见下表。
a.ESI+源梯度洗脱条件
时间，min | 流速，mL/min | 甲酸溶液，% | 甲醇/乙腈（1：1） | 曲线（curve） |
0 | 0.3 | 70 | 30 | 1 |
4.0 | 0.3 | 55 | 45 | 6 |
14.0 | 0.3 | 0 | 100 | 6 |
15.0 | 0.3 | 0 | 100 | 6 |
15.1 | 0.3 | 70 | 30 | 6 |
a.ESI-源梯度洗脱条件
时间，min | 流速，mL/min | 乙酸溶液，% | 甲醇/乙腈（1：1） | 曲线（curve） |
0 | 0.3 | 70 | 30 | 1 |
8.0 | 0.3 | 10 | 90 | 6 |
13.0 | 0.3 | 10 | 90 | 6 |
13.1 | 0.3 | 70 | 30 | 6 |
20.0 | 0.3 | 70 | 30 | 6 |
4.2 质谱条件
a离子源：电喷雾离子源。
b扫描方式：正离子扫描模式和负离子扫描模式。
c检测方式：多反应监测。
d脱溶剂气，锥孔气均为高纯氮气，碰撞气为高纯氩气，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求。
e毛细管电压，锥孔电压，碰撞能量等电压值应优化至灵敏度。
f定性离子对，定量离子对，保留时间及对应的锥孔电压和碰撞能量参考值见下表
a.ESI +监测模式
真菌毒素名称 | 保留时间min | 定性离子对m/z | 定量离子对m/z | 锥孔电压V | 碰撞能量eV |
黄曲霉毒素B1 | 13.7 | 313.1>241.1 313.1>285.1 | 313.1>241.1 | 39 | 32 20 |
黄'曲霉毒素B2 | 13.2 | 315.1>259.1 315.1>287.0 | 315.1>259.1 | 44 | 28 24 |
黄曲霉毒素G1 | 12.6 | 329.0>243.1 329.0>283.1 | 329.0>243.1 | 40 | 26 24 |
黄曲霉毒素G2 | 12.0 | 331.0>245.1 331.0>217.1 | 331.0>245.1 | 42 | 32 20 |
T-2毒素 | 16.0 | 489.1>245.2 489.1>387.1 | 4489.1>245.2 | 38 | 25 21 |
b.ESI-监测模式
真菌毒素名称 | 保留时间min | 定性离子对m/z | 定量离子对m/z | 锥孔电压V | 碰撞能量eV |
玉米赤霉烯酮 | 13.4 | 317.0>175.1 317.0>273.1 | 317.0>175.1
| 40 | 26 26 |
5.定性测定
在相同实验条件下，样品中待测物质保留时间与标准溶液保留时间的偏差不超过标准溶液保留时间的±2.5%，且样品中各祖坟定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过下表的范围，可判定样品中存在对应的待测物。
定性确证时相对离子丰度的大允许偏差（%）
相对离子丰度 | >50 | >20-50 | >10-20 | ≦10 |
允许的大偏差 | ±20 | ±25 | ±30 | ±50 |
6.定量测定
在仪器工作条件下，混合标准工作液与试样交替进样，采用基质匹配标准溶液校正，外标法定量。
品牌：科乐福clover
生产厂家:北京中检维康生物技术有限公司
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