显微镜七种观察方法

　　一、明视野观察(Bright field)

　　明视野镜检是大家比较熟悉的一种镜检方式，也是应用*广泛的显微镜观察方式.它广泛应用于金相、病理、检验等，所有显微镜均能完成此功能。

　　二、暗视野观察(Dark field)

　　暗视野实际是暗场照明发，它的特点和明视野不同，不直接观察到照明的光线，而观察到的是被检物体反射或衍射的光线。因此，视场成为黑暗的背景，而被检物体则呈现明亮的象。 暗视野的原理是根据光学上的丁道尔现象，微尘在强光直射通过的情况下，人眼不能观察，这是因为强光绕射造成的。若把光线斜射它，由于光的反射，微粒似乎增大了体积，为人眼可见。 暗视野观察所需要的特殊附件是暗视野聚光镜。它的特点是不让光束由下至上的通过被检物体，而是将光线改变途径，使其斜射向被检物体，使照明光线不直接进入物镜，利用被检物体表面反射或衍射光形成的明亮图象。暗视野观察的分辨率远高于明视野观察，*高达0.02—0.004um。

　　三、相差镜检法(Phase contrast)

　　在光学显微镜的发展过程中，相差镜检术的发明成功，是近代显微镜技术中的重要成就。我们知道，人眼只能区分光波的波长(颜色)和振幅(亮度)，对于无色通明的生物标本，当光线通过时，波长和振幅变化不大，在明场观察时很难观察到标本.

　　相差显微镜利用被检物体的光程之差进行镜检，也就是有效地利用光的干涉现象，将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差，即使是无色透明的物质也可成为清晰可见。这大大便利了活体细胞的观察，因此相差镜检法广泛应用于倒置显微镜。 相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ(波长)，如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处： 1. 环形光阑(annular diaphragm)位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。 2. 相位板(annular phaseplate)在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种：

　　A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差(或称负反差)

　　B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差(或称正反差)，结构比周围介质更加变暗

　　四、微分干涉称镜检术(Differential interference contrast DIC)

　　微分干涉镜检术出现于60年代，它不仅能观察无色透明的物体，而且图象呈现出浮雕壮的立体感，并具有相衬镜检术所不能达到的某些优点，观察效果更为逼真。 微分干涉称镜检术是利用特制的渥拉斯顿棱镜来分解光束。分裂出来的光束的振动方向相互垂直且强度相等，光束分别在距离很近的两点上通过被检物体，在相位上略有差别。由于两光束的裂距极小，而不出现重影现象，使图象呈现出立体的三维感觉。 DIC显微镜的物理原理完全不同于相差显微镜，技术设计要复杂得多。DIC利用的是偏振光，有四个特殊的光学组件：偏振器(polarizer)、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器(analyzer)。偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。在聚光器中则安装了偌玛斯斯棱镜，即DIC棱镜，此棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光(x和y)，二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。*初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，引起了两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个偌玛斯斯棱镜，即DIC滑行器，它把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面(x和y)仍然存在。*后光束穿过第二个偏振装置，即检偏器。在光束形成目镜DIC影像之前，检偏器与偏光器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，从而使二者发生干涉。x和y波的光程差决定着透光的多少。光程差值为0时，没有光穿过检偏器;光程差值等于波长一半时，穿过的光达到*大值。于是在灰色的背景上，标本结构呈现出亮暗差。为了使影像的反差达到*佳状态，可通过调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差，光程差可改变影像的亮度。调节DIC滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕。

　　五、偏光显微镜(Polarizing microscope )

　　偏光显微镜是鉴定物质细微结构光学性质的一种显微镜。凡具有双折射的物质，在偏光显微镜下就能分辨的清楚，当然这些物质也可用染色发来进行观察，但有些则不可能，而必须利用偏光显微镜。 偏光显微镜的特点，就是将普通改变为偏光进行镜检的方法，以鉴别某一物质是单折射(各向同行)或双折射性(各向异性)。 双折射性是晶体的基本特性。因此，偏光显微镜被广泛地应用在矿物，化学等领域。在生物学和植物学也有应用。

　　六、浮雕相衬显微镜(RC)

　　1975年，Robert Hoffman 博士发明。2002年，**到期，各显微镜厂家纷纷推出采用以自己名义命名的RC技术产品。 斜射光照射到标本产生折射、衍射，光线通过物镜光密度梯度调节器'>调节器产生不同阴影，从而使透明标本表面产生明暗差异，增加观察对比度。 其特点：提高未染色标本的可见性和对比度;图象显示阴影或近似三维结构而不会产生光晕;可检测双折射物质(岩石切片、水晶、骨头) ;可检测玻璃,塑料等培养皿中的细胞,器官和组织;聚光镜的工作距离可以设计的更长;RC物镜也可用于明场,暗场和荧光观察。

　　七、荧光显微镜(Fluorescence Microscopy)

　　荧光镜检术是用短波长的光线照射用荧光素染色过的被检物体，使之受激发后而产生长波长的荧光，然后观察。 优点：· 检出能力高(放大作用)· 对细胞的刺激小(可以活体染色)· 能进行多重染色 用途：· 物体构造的观察——荧光素· 荧光的有无、色调比较进行物质判别——抗体荧光等· 发荧光量的测定对物质定性、定量分析。