小鼠尿微量白蛋白(ALB)ELISA试剂盒使用说明书

小鼠尿微量白蛋白(ALB)ELISA试剂盒使用说明书
本试剂盒仅供体外研究使用!

预期应用

ELISA法定量测定小鼠尿液或其它相关生物液体中ALB含量。

 

实验原理

用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗  ALB抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗 ALB抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物 TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成*终的黄色。颜色的深浅和样品中的ALB呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度( OD值)，计算样品浓度。

 

试剂盒组成及试剂配制

1.        酶联板：一块(96孔)

2.        标准品(冻干品)：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为100ug/ml，做系列倍比稀释(注：不要直接在板中进行倍比稀释)后，分别稀释成100 ug/ml，50 ug/ml，25ug/ml，12.5 ug/ml，6.25 ug/ml，3.12 ug/ml，1.56 ug/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0ug/ml，临用前15分钟内配制。如配制 50 ug/ml标准品：取0.5ml (不要少于0.5ml )  100ug/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

3.        样品稀释液：1×20ml。

4.        检测稀释液A：1×10ml。

5.        检测稀释液B：1×10ml。

6.       检测溶液A：1×120μl(1:100)临用前以检测稀释液A1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(100μl/孔)，实际配制时应多配制 0.1-0.2ml。如10μl检测溶液A加990μl检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

7.       检测溶液B：1×120μl/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。

8.        底物溶液：1×10ml/瓶。

9.       浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

10.    终止液：1×10ml/瓶(2N H2SO4)。

11.    覆膜：5张

12.    使用说明书：1份

 

 

 

自备物品

1.   酶标仪(建议参考仪器使用说明提前预热)

2.   微量加液器及吸头，EP管

3.   蒸馏水或去离子水，全新滤纸

 

标本的采集及保存

1.       尿液：请收集清晨**次尿液(中段尿)，或24小时尿液，2000 xg离心15分钟后收集上清，并将标本保存于-20℃，且应避免反复冻融。

2.        其它生物标本：请1000 xg离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

注：以上标本置4℃保存应小于1周，-20℃或-80℃均应密封保存，-20℃不应超过1个月，-80℃不应超过2个月；

 

操作步骤

实验开始前，各试剂均应平衡至室温(试剂不能直接在37℃溶解)；试 剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。

1.       加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.       弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加  检测溶液A工作液100μl(在使用前一小时内配制)，酶标板加上覆膜，37℃反应60分钟。

3.       温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。

4.       每孔加检测溶液B工作液(同检测A工作液) 100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。

5.       温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。

6.       依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色(30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止)。

7.       依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.       用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后立即进行检测。

 

注：

1.  试剂准备：所有试剂都必须在使用前达到室温，使用后请立即按照说明书要求保存试剂。 实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。

2.   加样：加样或加试剂时，请注意在吸取标本 /标准品，酶结合物或底物时，**个孔与*后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的“预孵育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。一次加样时间(包括标准品及所有样品)*好控制在 10分钟内，如标本数量多，推荐使用多道移液器加样。

3.  孵育：为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜，以避免液体蒸发；洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态;同时应严格遵守给定的孵育时间和温度。

4.  洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响*后的酶标仪读数。

5.  试剂配制：Detection A及DetectionB在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。请精确配置标准品及工作液，尽量不要微量配置(如吸取检测溶液A时，一次不要小于10μl)，以避免由于不准确稀释而造成的浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。

6. 反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化(比如，每隔10分钟)，如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。

7.  底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。

    建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。

    如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请*后乘以稀释倍数。

 

洗板方法

1. 手工洗板方法：吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。

2.  自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

 

特异性

    本试剂盒可同时检测重组或天然的小鼠ALB，且与其它相关蛋白无交叉反应。

 

计算

  以标准物的浓度为纵坐标(对数坐标)，OD值为横坐标(对数坐标)，在对数坐标纸上绘出标准曲线。推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如 curve expert1.3，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

 

检测范围：1.56 ug/ml - 100 ug/ml

 

*低检测限：0.39 ug/ml

 

说明

1.        在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，试剂避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。

2.        试剂盒保存：请收到试剂盒后尽快将标准品、检测溶液A和检测溶液B保存于-20℃，其余试剂短期保存请置于4℃，长期保存则置于-20℃。

3.        浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。

4.        刚开启的酶联板孔中可能会有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。

5.        所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。

6.         有效期：6个月。

7.        本操作说明适用于48T试剂盒，但48T试剂盒所有试剂减半。