ELISA的基本原理、应用及方法和类型

ELISA的三个基本原理：

（1）抗原或抗体可以物理吸附在固体载体表面，可能是因为蛋白质和聚苯乙烯表面之间的疏水部分相互吸附并保持其免疫活性；

（2）抗原或抗体可以通过共价键与酶连接形成酶结合物，这种酶结合物仍可以保持其免疫和酶促活性；

（3）将酶偶联物与相应的抗原或抗体结合后，可以使用添加的底物的颜色反应来确定是否存在免疫反应，并且颜色反应与相应的量成正比。样本中的抗原或抗体。因此，可以根据基材的显色程度按比例显示测试结果。

ELISA法是一种新的免疫诊断技术，已成功应用于各种病原微生物引起的传染病，寄生虫病和非传染病的免疫诊断。它也已用于定量测定大分子抗原和小分子抗原。根据已使用的结果，ELISA方法被认为是灵敏，特异，简单，快速，稳定且易于自动化的。它不仅适合于临床标本的检查，而且因为一天之内可以检查成百上千的标本，还适合于血清流行病学研究。该方法不仅可以用于确定抗体，还可以用于确定体液中的循环抗原，因此也是早期诊断的好方法。因此，ELISA法在生物医学各个领域的应用范围正在日益扩大，可以概括为四个方面：1.免疫酶染色的各种细胞内成分的定位。 2.研究抗酶抗体的合成。 3.显示出微量的免疫沉淀反应。 4.定量检测体液中的抗原或抗体成分。

方法1：双抗体夹心法检测未知抗原：

1。涂层：使用0.05M PH9。碳酸盐包被缓冲液可将抗体稀释至1-10μg/ ml的蛋白质含量。向每个聚苯乙烯板的反应孔中加入0.1ml，在4°C下过夜。第二天，将溶液丢弃在孔中，并用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3分钟。 （以下简称为洗涤，下同）。

2。样品添加：将0.1ml某种待稀释的待测样品加入上述包被的反应孔中，并在37℃下孵育1小时。然后洗净。 （同时制作空白孔，负控制孔和正控制孔）。

3。 “添加酶标抗体：在每个反应孔中加入0.1ml新鲜稀释的酶标抗体（滴定后稀释后稀释）。在37°C孵育0.5至1小时，然后洗涤。

4。 “添加底物溶液以显色：在37°C下将0.1ml临时制备的TMB底物溶液添加到每个反应孔中10-30分钟。

5。 “停止反应：向每个反应孔中加入0.05ml 2M硫酸。

6。结果判断：可以在白色背景上用肉眼直接观察到它。结果：反应中的颜色越深，阳性程度越强，而阴性反应则无色或非常淡。根据颜色深度，“ +”和“-”表示。还可以测量O·D值：在ELISA测试仪上，在450nm处（如果ABTS用于显色，则为410nm），将空白对照孔设为零，然后测量每个孔的O·D值。如果它大于指定的阴性对照OD 2.1倍，则认为该值为阳性。

方法2：间接检测未知抗体的方法：

用包被缓冲液将已知抗原稀释至1-10μg/ ml，向每个孔中加入0.1ml，在4°C下过夜。第二天洗3次。

向上述包被的反应孔中加入0.1ml稀释的样品（未知抗体），在37°C下孵育1小时，然后洗涤。 （同时作为空白，阴性和阳性孔对照）

在反应孔中，加入0.1ml新鲜稀释的酶标记的第二抗体（抗抗体），在37°C下孵育30-60分钟，洗涤，并在*之后用DDW洗涤。

其余步骤与“双抗体夹心法”的4、5和6相同。