人25羟基维生素D3(25(OH)D3)ELISA试剂盒

人25羟基维生素D3(25(OH)D3)ELISA试剂盒说明书

人25羟基维生素D3(25(OH)D3)ELISA试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断

人25羟基维生素D3(25(OH)D3)ELISA试剂盒说明书

检测原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被25羟基维生素D3(25(OH)D3)抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成*终的黄色。颜色的深浅和样品中的25 羟基维生素D3(25(OH)D3)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。

样品收集、处理及保存方法:

1.血清:使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液:3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

5.保存:如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品:

1.37℃恒温箱

2.酶标仪(450nm)

3.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

操作注意事项:

1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。

2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封(低温干燥)保存。

3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，*终结果乘以5才是样本实际浓度。

4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

5.所有液体组分使用前充分摇匀。

人25羟基维生素D3(25(OH)D3)ELISA试剂盒组成:

名称96孔配置48孔配置备注

微孔酶标板12 孔×8 条12 孔×4 条无

标准品0.3mL*6 管0.3mL*6 管无

样本稀释液6mL 3mL 无

检测抗体-HRP 10mL 5mL 无

20×洗涤缓冲液25mL 15mL 按说明书进行稀释

底物A 6mL 3mL 无

底物B 6mL 3mL 无

终止液6mL 3mL 无

封板膜2 张2 张无

说明书1 份1 份无

自封袋1 个1 个无

注：标准品(S0-S5)浓度依次为：0、3、6、12、24、48 ng/mL

试剂的准备:20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1:20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

洗板方法:

1.自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

2.手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min 后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。

操作步骤:

1.从室温平衡20min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5 次(也可用洗板机洗板)。

6.每孔加入底物A、B 各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min 内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断:

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

试剂盒性能:

1.准确性:标准品线性回归与预期浓度相关系数R 值，大于等于0.9900。

2.灵敏度:*低检测浓度小于1.0 ng/mL。

3.特异性:不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重复性:板内、板间变异系数均小于15%。

5.贮藏:2-8℃，避光防潮保存。

6.有效期:6 个月