冻猪胃中鼠伤寒沙门氏菌的分离与鉴定-ATP荧光检测仪技术文章

冻猪胃中鼠伤寒沙门氏菌的分离与鉴定-ATP荧光检测仪技术文章

沙门氏菌是重要的人畜共患病病原,引起人和动物伤寒、副伤寒和食物中毒,临床表现为
急性胃肠炎症,有突发性剧烈头痛、腹泻、呕吐、感觉不适和体温升高等。我们对送检的冷冻猪
副产品(猪胃) 进行致病菌检验,结果分离出一株鼠伤寒沙门氏菌,抗原式为4 ,5 :i :1 ,2 。现将
细菌的分离、鉴定、试验动物致病性试验以及药敏试验情况报告如下。
1 　试验材料
1. 1 　被检材料　客户送检的冻猪胃,于- 30 ℃冰箱保存。
1. 2 　培养基　营养肉汤、亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC) 、DHL 琼脂、三糖铁琼脂( TSI) 、均购自北京陆桥微生物制剂有限公司。氯化三苯四氮唑动力鉴别培养基( TTC) 和绵羊鲜血琼脂平板自备。
1. 3 　细菌微量鉴定管(批号为20011012) 和药敏试纸(批号为20011120) 　购自杭州天和微生物试剂有限公司。
1. 4 　沙门氏菌诊断血清　购自兰州生物制品研究所,批号为20011004 。
1. 5 　试验动物　15 克左右的小白鼠,购自广西医科大学实验动物饲养车间。
2 　实验室检验
2. 1 　细菌增菌培养　待检冻猪胃,于37 ℃待其解冻后,按随机取样的方法,无菌剪取猪胃25 克,加在装有225ml 营养肉汤的均质器内,以8000r/ min 打碎1min , 转至500ml 广口瓶内,于3615 ℃培养4h ,移取10ml 转种于100mlSC 增菌液内,于3615 ℃培养24h 。
2. 2 　细菌的分离培养　取SC 增菌液一环,接种于二个DHL 平板,3615 ℃培养24h 观察结果。结果在DHL 琼脂平板上分离出边缘透明、ZX呈黑色的单个菌落,成片生长的菌落几乎全呈黑色。挑取单个菌落接种普通营养琼脂和血琼脂平板,进一步分离纯化后接种营养肉汤;接种TSI 琼脂斜面,转种时先穿刺底层再涂布斜面;穿刺接种TTC 鉴别培养基,于3615 ℃培养24h 。结果分离出一株细菌,该菌株在肉汤表面形成菌膜,肉汤均匀混浊,管底有灰白色沉淀物;普通营养琼脂上的菌落,无色透明,表面光滑,圆形较为扁平、粘稠;在血琼脂上的菌落,无色透明,表面光滑,菌落比普通营养琼脂上的大2～3 倍,并形成溶血环; TSI 琼脂斜面变红,底层产酸产气,H2S 阳性;分离菌在TTC 上有运动性,并形成粉红色菌膜。
3 　细菌的鉴定
3. 1 　细菌形态特征观察　将24h 血琼脂斜面培养的纯菌落,加生理盐水均匀涂片,火焰固定,革兰氏染色后观察。结果为革兰氏阴性无芽孢短杆菌,大小均匀,单在、两端钝圆。
3. 2 　生化试验　按ZG食品沙门氏菌检验标准( GB4789. 4 - 1994) 的方法进行生化试验,分离菌株的生化反应试验结果为:H2S( + ) 、靛基质( - ) 、尿素( - ) 、KCN 生长管( - ) 、KCN 对照管( + ) 、赖氨酸脱羧酶( + ) ,根据标准中肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表初步鉴定为沙门氏属细菌。
3. 3 　梅里奥微生物自动分析仪鉴定细菌　取鲜血平板上培养18h 的纯菌落,按自动分析仪操作要求对分离菌作沙门氏菌证实试验。鉴定卡的30 项生化指标试验结果如下: 三氯新( - ) 、尿素( - ) 、麦芽糖( + ) 、肌醇( - ) 、阿拉伯
糖( + ) 、葡萄糖氧化( + ) 、枸椽酸盐( + ) 、甘露醇( + ) 、侧金盏花醇( - ) 、葡萄糖发酵( + ) 、阳性生长YZ( + ) 、丙二酸盐( - ) 、木糖( + ) 、香豆酸( - ) 、精氨酸( - ) 、乙酰氨( - ) 、苯丙氨酸( - ) 、H2S( + ) 、棉子糖( - ) 、赖氨酸( + ) 、七叶树苷( - ) 、多粘菌素B ( - ) 、山梨醇( + ) 、β- 半乳糖苷酶( - ) 、鸟氨酸( + ) 、植物尿蓝母( - ) 、乳糖( - ) 、蔗糖( - ) 、鼠李糖( + ) 、氧化酶( - ) 。培养8h ,自动分析仪报告*终鉴定结果,100 %为沙门氏菌。
3. 4 　血清学分型试验　采用玻片凝集法,在洁净玻片上滴加一滴A - F 多价O 血清,用接种针挑取鲜血平板上纯化的菌落,与血清混合均匀,结果在30 秒钟内出现凝集反应,而生理盐水对照为阴性;接着用各群O 抗原因子血清,
即O1 、O2 、O4 、O5 、O7 、O8 、O9 、O10 、O11 对被检菌逐一进行凝集试验检查,再用阳性反应群
所包含的各个O 因子血清确定其O 抗原组成,然后再用该菌所属群的H 因子血清检查第1相和第2 相的H 抗原。结果被检菌株的抗原式为:4 ,5 :i :1 ,2 。经血清型鉴定,该菌株为鼠伤寒沙门氏菌。
4 　致病性试验
取15 克左右健康小白鼠8 只,分成两组,**组5 只,每只腹腔接种含1. 3 亿分离菌的肉汤培养物稀释液011ml ,第二组3 只,每只注射生理盐水011ml 作为对照。结果接种后24h ,注射被检菌的小白鼠活动减少,被毛松散,毛色失去光泽,蹲伏在饲养笼的角落处,在35- 40h 之间5 只小白鼠全部死亡,尸检见肠粘膜充血,肝充血肿大,用接种环取肝组织划线接种DHL 琼脂平板,结果重新分离出被检菌。对照组小白鼠正常。
5 　药敏试验
按常规纸片法进行试验,分离菌的药敏试验结果为:丁胺卡那18 毫米、FF新诺明0 毫米、先锋V 26 毫米、青霉素0 毫米、氨苄青霉素15 毫米、红霉素0 毫米、氯霉素25 毫米、氟哌酸30 毫米、环丙沙星25 毫米、庆大霉素20 毫
米。
6 　小结与讨论
6. 1 　经病原的分离培养以及细菌鉴定,证实从冻猪胃分离到的细菌为鼠伤寒沙门氏菌,抗原模式为:4 ,5 :i :1 ,2 。该型细菌具有广泛的致病力,可致人类的食物中毒,能引起各种禽畜以及实验动物发病。病原随污染的食物、饲料和水源等经口途径感染进入小肠,大量繁殖,产生肠毒素,引起腹泻、呕吐;细菌侵入肠下部的集合淋巴结以及孤立淋巴滤泡,经淋巴管到达肠系膜淋巴结并大量增殖,当细菌溶解后释放出内毒素,毒素进入血液时出现发热、全身不适等症状。从送检的冰冻猪胃中检出鼠伤寒沙门氏菌,该批食品巳不符合食品卫生检验标准,对人体健康潜在严重的威胁,因此,要求客户对同批全部冻猪胃作无害化处理。
6. 2 　沙门氏菌不同血清型对不同种类动物的致病性不完全相同,少数血清型具有高度的选择性,如伤寒和副伤寒沙门氏菌仅对人有致病性;同一菌型对不同种动物感染致病的剂量以及感染途径和动物的状态有关,文献报道,鼠伤
寒沙门氏菌静脉注射小白鼠,可自肠道排出细菌,具有高度传染性,而自小白鼠腹腔途径接种小白鼠,病原菌不经肠道排出。我们选择小白鼠腹腔注射113 亿分离菌,接种的5 只小白鼠在40h 内全部死亡,说明分离出的细菌具有强
致病力;选择腹腔接种,减少了病原菌污染试验场地和向周围环境扩散的危险性。
6. 3 　分离的鼠伤寒沙门氏菌,对先锋ⅴ、氯霉素、氟哌酸、环丙沙星高敏,对丁胺卡那、氨苄青霉素、庆大霉素中敏,而对FF新诺明、青霉素和红霉素耐药。根据药敏试验结果,如果感染鼠伤寒沙门氏菌引起人的食物中毒以及动物发病,可作为用药参考。

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