Northern杂交技术基本原理-仪器结构|技术参数|功能特点|规格

北部杂交与南部杂交非常相似。主要区别在于检测到的对象是RNA，其电泳是在变性条件下进行的，以去除RNA中的二级结构并确保RNA完全按照分子大小分离。变性电泳主要有三种类型：乙二醛变性电泳，甲醛变性电泳和羟甲基汞变性电泳。电泳后，琼脂糖凝胶使用与Southern转移相同的方法将RNA转移到硝酸纤维素滤膜上，然后与探针杂交。
1。材料：要检测的RNA和准备的探针。
2。设备：电泳仪，电泳槽，塑料盆，真空烘箱，放射自显影盒，X射线胶片，杂交袋，硝化纤维素膜或尼龙膜。
3。试剂：（1）20×SSPE：175.3g NaCl，88.2g柠檬酸钠，溶于800ml水中，用10mol / L NaOH将pH调节至7.4，然后溶解至1L。 （2）其他试剂：与Southern杂交试剂相似，不同之处在于所有试剂均经过DEPC处理。
4。操作步骤：（1）将RNA变性并电泳后，可以立即将乙醛酸RNA转移到硝酸纤维素滤膜上。转移方法类似于转移DNA的方法。
（2）转移完成后，在室温下用6xSSC溶液浸泡膜5分钟以去除琼脂糖碎片。
（3）将杂化膜夹在两张滤纸之间，并在80℃的真空烘箱中干燥0.5-2小时。
（4）使用以下两种溶液之一进行预杂交1-2小时。如果在42℃下进行，则应使用：50％甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardts试剂，0.1％SDS；如果在68℃下进行，则应使用：6×SSC，2×Denhardts试剂，0.1％SDS（注意：BLOTTO不能用于Northern杂交）。
（5）将变性的放射性标记探针添加到预杂交溶液中。如果要检测低丰度mRNA，探针的用量应至少为0.1μg，比活度应大于2×108 cpm / min·Μg，在合适的温度条件下杂交16-24小时。
（6）在室温下用1×SSC，0.1％SDS洗涤膜20分钟，然后在68℃下用0.2×SSC，0.1％SDS洗涤膜3次，每次20分钟。
（7）用X射线胶片（Kodak XAR-2或其等效物）进行放射自显影，并在附加的增感屏的作用下于-70℃曝光24-48小时。
[注]（1）如果琼脂糖浓度高于1％，或凝胶厚度大于0.5cm，或待分析的RNA大于2.5kb，则需要将凝胶浸入0.05mol / L NaOH 20分钟以部分水解。

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