粪大肠菌群检测方法研究进

　　摘　要：粪大肠菌群是水体粪便污染的指示菌。详细介绍了多管发酵法、滤膜法、纸片法、酶底物法及分子生物学

　　方法检测粪大肠菌群的优缺点及主要应用实例。

　　关键词：粪大肠菌群;多管发酵法;滤膜法;纸片法;酶底物法

　　粪大肠菌群检测方法研究进展

　　粪大肠菌群是一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，是当前国内、外环境监测部门评价水体污染程度的公认指标和主要监测项目之一，具有广泛的卫生学意义。精确、快速、可靠的粪大肠菌群检测方法对于准确及时地监测水域粪大肠菌群的污染状况，有效预报和控制流行疾病的发生与传播有重要意义。

　　1　粪大肠菌群的检测方法

　　1.1　多管发酵法

　　1.1.1　原理

　　利用大肠菌群繁殖时使乳糖发酵，并能使乳糖蛋白胨培养液变黄，同时产生气泡。

　　1.1.2　检测方法

　　1.1.2.1

　　水样接种量将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用3个不同的水样量接种。同一接种水样量要有5管。相对未受污染的水样接种量为10、1、0.1mL;受污染水样接种量根据污染程度接种1、0.1、0.01mL或0.1、0.01、0.001mL等。如接种体积为10mL，则试管内应装有3倍浓度乳糖蛋白胨培养液5mL;如接种量为1mL或少于1mL，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL中。

　　1.1.2.2

　　初发酵实验将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中，在37±0.5℃下培养24±2h。产酸和产气的发酵管表明试验阳性。如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。

　　1.1.2.3

　　复发酵实验轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm接种环或灭菌棒将培养物转接到EC培养液中。在44.5±0.5℃水浴下培养24±2h。培养后立即观察，若发酵管产气，则表明确信试验阳性。

　　1.1.2.4　计算和报告结果

　　根据不同接种量的发酵管所表现阳性结果的数目，从MPN表中查得相应的MPN 指数，计算每升水中粪大肠菌群数的*近似值(Most　probablenumber，MPN)。

　　1.2　滤膜法[1](Membrane　tilter，MF)

　　1.2.1　原理

　　将水样注入已灭菌的放有滤膜(孔径为0.45μm)的滤器中，经过抽滤，细菌即被截留在膜上，然后将滤膜贴于M-FC培养基上，44.5℃温度下进行培养。

　　1.2.2　检测方法

　　1.2.2.1　水样抽滤

　　于滤器内先加入约10mL已灭菌的去离子水，然后再用已灭菌吸量管吸取一定量的充分混匀的待检水样，加入滤器中。在负压50kPa下进行抽滤，快滤完前加入灭菌水少许以冲洗滤器内壁，使水样内的细菌全部集中于滤膜上。

　　1.2.2.2　细菌培养

　　用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在M-FC培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜与培养基完全紧贴不能有气泡，然后将平板倒置，置于44.5±0.5℃的恒温培养箱或恒温水浴中，培养24±2h。

　　1.2.2.3　计数和报告结果

　　粪大肠菌群菌落在M-FC培养基上呈蓝色或蓝绿色，其它非粪大肠菌群菌落呈灰色、淡黄色或无色。正常情况下，由于温度和玫瑰酸盐试剂的选择性作用，在M-FC培养基上很少见到非粪大肠菌菌落。必要时可将可疑菌落接种于EC培养液，44.5±0.5℃培养24±2h，如产气则证实为粪大肠菌群。计数呈蓝或蓝绿色的菌落，计算出每1L水样中的粪大肠菌群数。

　　1.3　纸片法(Paper　strip　method)

　　1.3.1　原理

　　纸片法是以纸片、纸膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过粪大肠菌群在上面的生长、显色来测定的方法，即粪大肠菌在纸片培养基上呈红色菌落，菌落周围产生黄圈是粪大肠菌分解乳糖产酸使指示剂变色的结果。

　　1.3.2　检测方法

　　(1)将适量待测液加到纸片上后于45℃培养18～24h。

　　(2)观察结果，根据阳性纸片张数，查MPN 值表，报出结果。

　　1.4　酶底物法(EST)

　　1.4.1　原理

　　酶底物法是利用大肠菌群细菌能产生β-半乳糖苷酶(β-D-Galaetosidase)分解PG(Orthonitropheny1-β-D-Galactopyranoside)使培养液呈黄色，以及大肠埃希氏菌产生葡萄糖醛酸酶(13-Glueuronidase)分解MUG(4-methY1-umbelllfery-β-DGlucuronide)使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光的原理，来定量分析水样中粪大肠菌群数。

　　1.4.2　检测方法

　　酶底物法采用51孔或97孔定量盘法。检测所需水样为100mL。

　　(1)用100mL无菌稀释瓶量取100mL水样，加入(2.7±0.5)g　MMO-MUG 培养基粉末，混摇均匀使之完全溶解，将水样全部倒入5l孔或97孔无菌定量盘内，以手抚平定量盘背面以赶除孔穴内气泡，然后用封口机封口。放入44℃培养箱中培养24h。

　　(2)培养后进行结果判读。如果孔穴内的水样变成黄色则表示该孔穴中含有大肠菌群。将定量盘在暗处用波长为366nm的紫外光灯照射，有黄色反应的孔穴如果有蓝色的荧光产生则表示该定量盘孔穴中含有大肠埃希氏菌。计算有黄色反应及有荧光的孔穴数，对照MPN 表查出其代表的粪大肠菌群*可能数。

　　1.5　聚合酶链式技术(Polymerase　chain　reaction，

　　PCR)

　　1.5.1　原理

　　利用PCR技术扩增编码约260bp的LacZ基因(β-半乳糖苷酶基因)和约150bp的Udi　A 基因(β-D-半乳糖苷酶基因)的DN***段，可以分别检

　　测大肠菌群数和大肠杆菌。

　　1.5.2　检测方法

　　(1)用适当方法提取粪大肠菌群混悬液和待测水样的DNA，提取的DN**段用紫外分光光度法测定纯度和浓度。PCR扩增反应，包括变性、退火和延伸的多次循环，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测。

　　(2)将粪大肠菌群混悬液和待测水样的PCR扩

　　增产物进行比较，根据DNA分子量推算，确定水样中粪大肠菌群数。

　　1.6　荧光原位杂交技术(Fluorescent　in　situ　hybridization，FISH)

　　1.6.1　原理

　　荧光原位杂交技术是根据粪大肠菌群特异的DNA序列，以利用荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针，与待测水样中DNA分子杂交，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量分析。

　　1.6.2　检测方法

　　(1)选择专门针对粪大肠菌群的荧光标记探针序列，利用寡核苷酸探针与靶细胞专一性结合进行生物分析。基本实验步骤为细胞固定、杂交、洗脱。

　　(2)杂交细胞通常用荧光显微镜检测，利用流式细胞仪对每一个靶细胞的探针杂交物的荧光强度进行定量测定，然后确定菌群数。

　　2　各种检测方法的比较

　　多管发酵法和滤膜法是粪大肠菌群标准检测方法，这2种方法检测时间相对较长(48～72h)，需确认试验，试验步骤较为繁琐，干扰因素多，不适于大量样品的分析，也不能对水的卫生学状况做出快速评价。但标准方法具有费用较低、原理简单、利于推广的优点，此仍是常规监测中的主要检测方法。纸片法和酶底物法，只需18～24h培养即可报告结果，操作简便，结果可靠，不需要确认试验，酶底物法还可同时检测水中大肠菌群和大肠埃希氏菌的污染状况。纸片法是ZG环境监测总站推荐的SY方法，酶底物法已经被世界各国国家及地方实验室和世界各组织机构认可，能够较精确地判断水样的微生物污染状况，适宜污染事故应急监测。PCR技术用于大肠菌群的检测仍然处于研究阶段，还有许多技术上的限制需要突破，技术复杂，检测费用较高，假阴性和假阳性的比例较高，缺乏精度，还有待于进一步改进，目前还不能广泛用于粪大肠菌群的日常检测。FISH 技术是细胞水平上的一

　　种高度专一性检测方法。它可以在8h内给出定量检测结果，有极低的假阳性和假阴性的比例。但其操作步骤较烦琐，技术复杂，目前仅可以对水样中低浓度菌群进行计数，不利于大规模推广，因此FISH技术没有广泛用于粪大肠菌群的常规监测。

　　3　各种检测方法的应用

　　多管发酵法和滤膜法是粪大肠菌群标准检测方法，是常规监测中的主要检测方法，本文主要介绍其它几种方法的应用。

　　3.1　纸片法

　　纸片法是ZG环境监测总站推荐的SY方法，适宜污染事故应急监测，在食品行业和食具消毒效果中广泛应用。顿玉慧[2]使用3MPetrifilm肠杆菌科检测纸片计数温州七里港口水域中的肠杆菌科，并同SN 方法进行检测比对，结果证明使用3MPetrifilm 检测片来检测水域中的肠杆菌科是可行的，2种方法检测的结果差异不显著。赵凌宇[3]采集苏州具有代表性的地表水水体22个点位的样品，进行粪大肠菌群的测定方法比较，认为纸片法适于测定受粪便污染程度较轻的湖泊水体。但是，该方法的培养时间对

　　阳性管率有明显影响，认为16～18h是比较理想的培养时间。赵春霞[4]用多管发酵法与快速纸片法进行标准菌株和环境水样的对比，认为纸片法操作和结果判断均较容易，精密度判断值R=0.219　5，在受控范围内，与多管发酵法的相关性也很好(r=

　　0.93)。林彩华[5]将3M Petrifilm 法应用于出口水产品的检测，认为3MPetrifilm法检测大肠菌群的灵敏度不够，无法检测每克样品含菌量10个以下。孔梅[6]利用纸片法对食具消毒效果进行检测，对出现可疑结果的纸片放入乳糖胆盐培养液中再按常规发酵法的程序进行大肠菌群检测，可提高纸片法的灵敏度，增加与常规发酵法的阳性符合率。2008年绿洲生化致病菌测试片系列产品在北京奥运会食品安全保障和抗震救灾中，成为卫生部指定采购产品;2009年病原微生物测试片项目被列入科技部科技型中小企业技术创新基金项目;2010年上海世博会和广州亚运会中，微生物快速检验产品进一步得到成功应用。

　　3.2　酶底物法

　　酶底物法已经被世界各国国家及地方实验室和世界各组织机构认可，能够较精确地判断水样的微生物污染状况，广泛用于粪大肠菌群的日常检测。孙宗科[7]应用加标试验和实际水样检测的方式比较酶底物法与多管发酵法用于水中大肠菌群的检测方法的优劣和结果的一致性，得出检测结果具有一致性(P=010　59)，假阳性率无统计学意义的差别(P

　　=1.000)，可以用作评价水质微生物污染的标准方法。赵春霞[4]用标准菌株和环境水样进行对比，酶底物法精密度判断值R=0.132　4，在受控范围内，与多管发酵法也具有良好的相关性(r=0.89)。郑晶[8]用酶底物法检测蔬菜中大肠菌群，与SN方法测试结果较为接近，无明显的差异。孙锡娟[9]用酶底物快速检测法检测粪源性污染的蔬菜样品，结果表明该法敏感性及准确性与多管发酵法相一致。2008年科立得协助北京自来水公司、北京环境监测站、ZG疾病预防控制ZX、北京疾病预防控制ZX、天津疾病预防控制ZX等完成奥运安全供水工作;美国爱德士(IDEXX)公司科立得试剂在地震灾区等条件恶劣地区仍能安全准确检测居民用水。

　　3.3　其它方法

　　Bej等[10]将多重PCR用于检测与总大肠菌群相关的基因序列，这些序列与肠道病原菌包括(E.coli，Salmoneiia　spp.和Shigella　app.)有关。Juck等[11]利用嵌套式PCR方法，并改进了Bej等提出的过滤方法，快速检测水样中低浓度的E.coli。明镇寰[12]对聚合酶链式反应(PCR)快速检测水体指示菌———大肠菌群和大肠杆菌进行了研究。采用的2对引物分别扩增了Lac　Z基因的约260bp和Udi　A基因的约150bp　DN**段。引物Ⅰ和引物Ⅱ*低能分别扩增10-6μg或10-8μg基因组DNA。整个检测工作在采集水样后5～6h内完成。与常规水质检测法相比，PCR法具有快速、准确的特点，是有效监测环境水体指示菌的一种潜在的新方法。Regnault等[13]利用Colinsitu探针检测了尿、水(河水和生活污水)以及食品中的E.coli和E.fergusonii。该探针对所研究的不同环境介质中的E.coli具有很好的专一性，已经成功地应用于饮用水样品中E.coli的检测。FISH 方法的优点是不可培养的大肠菌群也可以被检测出，其缺点是死细胞也可能被计数。因此，利用FISH 方法对细菌计数后，尚需对细菌的生理状态进行进一步研究。黄小平[14]应用显色荧光方法检测牛奶或水中大肠菌群和大肠杆菌，该方法不需验证步骤，研究过程中没有发现假阳性和假阴性现象出现，灵敏度可达到1～5/100mL。涂楚国[15] 研究出Lactose-__<___o___Tryptone-SodiumDodecyl　sulfate-Trace　Elements(LTSE)培养基，采用几种鉴定验证试验的LTSE法，用来快速检测水质、食品、冷饮、餐具等各类样品703件，结果与国标法(GB)对照总符合率为99.3%;同时与美国《水和废水标准检验法》(16版1985年)中检测粪大肠菌群的正式A-1法相比较特异性强，灵敏度高，能提高检出率，并节约经费。张江龙[16]利用法国COLILERTR3000大肠杆菌在线自动监测仪，检测到1个或更多大肠杆菌/100mL水的时间不足18h，对于大肠杆菌污染较严重的水体来说，数小时之内就能检测出来，较传统的实验室方法，大大缩短了测量时间，而且可以对水体中微生物的性质进行长期不间断的采样分析;由于COLILERTR试剂对大肠杆菌有非常高的选择性(这点已被世界上许多国家的研究机构所证实和认可，并通过了美国USEPA 证实且被收录到美国标准分析方法)，该仪器的分析结果可信度极高。另外一种相对较快的大肠杆菌检测设备是军事医学科学院研制的水质细菌检验箱，其基本原理是使用滤漠-营养垫法，所用的培养基是新研制的改良远藤培养基，比普通的远藤培养基能获得更加满意的检验结果，尤其是对水中损伤大肠菌的检验有较好的效果，6～15h后可得到粪大肠菌群数的监测结果;价格也不贵。适用于各级卫生防疫部门，水厂及饮水卫生检验单位、野外工作单位等在实验室或野外条件下进行水中细菌总数和大肠菌群的检验。

　　4　结　语

　　目前，大肠菌群检测方法发展很快，已提高到分子生物学水平，使检测更快速、准确。新检测技术的应用普及，不仅与操作技术的简易程度和精确度有关，也与检测设备和试剂的费用高低、对环境的影响等有关。因此要实现实际操作应用与普及还需要经历一个长期的反复验证完善过程，需要不断改进操作细节，使新技术的精确度得到认可。纸片法和酶底物法以其操作简便、检测周期短，将取代多管发酵法、滤膜法等传统方法，尤其是酶底物法采用密封培养技术，在检测医院污水时可以减少人员接触而降低检测人员的致病风险，因此具有更强的实用价值和应用价值，极有可能在近期成为评价水质微生物污染的快速标准检测方法之一。自动化检测方法亦将是监测工作的发展方向，在新技术支持下，精确、快速、可靠、环保、低廉的自动检测仪器也将会被研发并得到应用与普及。