常用分子杂交简介基本原理-仪器结构|技术参数|功能特点|规格

一 原位分子杂交（in situ hybridization）　细菌原位杂交：原位分子杂交有两类，一类是玻片原位杂交，另一类是膜上原位杂交。前者一般都先要制片，如中期染色体片和组织切片等，片子制好后不染色，放在缓冲溶液中缓缓变性，然后再加入探针让其复性，将没有结合的探针充分洗脱，若是同位素标记探针，就须在片子上涂一层乳胶或覆盖上一张同样大小X光片进行放射自显影，然后观察同位素的爆光点在组织或染色体分裂相上的相对位置。如用荧光标记可用荧光显微镜直接观察。近年来已发展了多色荧光技术。原位分子杂交可用来进行染色体的基因定位，或观察组织中不同的 RNA的分布。在果蝇早期的发育中，就采用了这种方法研究不同基因的表达调控。膜上分子杂交是将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜上（以前用硝酸纤维膜），这种膜只吸附单连DNA。将影印好的膜用NaOH处理，这样不仅可以杀死细菌，同时可使DNA变性吸附在膜上，然后用无关的单链DNA，如小牛胸腺DNA和鲑鱼精子DNA吸附到膜上的空白处，称预杂交，防止探针被吸附在背景上，干扰实验结果，膜经中和、烤干后再将同位素探针和膜放在缓冲溶液中缓缓复性，经放射自显影来确定阳性菌落。这种方法常用来从基因文库（gene bank或gene library）中来钓基因。组织原位杂交： 简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。菌落原位杂交需裂解细菌释出 DNA ，然后进行杂交。而原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与 DNA 或 RNA 杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置。
 二 斑点杂交（dot blotting）斑点杂交也叫狭缝杂交。是由Southern blot衍生而来。方法是将某种生物的总DNA直接点滴在尼龙膜上，或者通过一个小的长形狭缝印在尼龙膜上，后将膜变性处理，预杂交后，经中和、洗脱、干燥。再将其和探针放入复性缓冲溶液中缓缓复性，洗涤干燥后进行放射自显影，观察结果。（图9-29）这种方法是用来初步探测某种生物中含有一种特殊的基因或序列。来分析DNA样品之间的同源性。此法因有假阳性的存在，所以发现阳性斑后还要进一步做Southern blotting加以验证。　
三. Southern 杂交　DNA 杂交是Southern,E.M于1975年首先建立的，故称为Southern杂交，该方法经 Southern 印迹法将胶上的电泳条带吸到印尼龙膜上，然后和DNA探针杂交，用这种方法可以制作染色体的物理图谱，限制性片段长度的多态性，及动物吸印（Zoo blot）（用一个物种的DNA探针和别种动物的DNA进行Southern blotting）等。
四. Northern杂交　作者Alwine,D.J.（1977）等都不姓“Northern”，因“Southern”意为“南方”，故戏称他们的分析方法为“北方”“（northern）杂交。northern 杂交与Southern杂交主要的不同之处在于检验物是RNA，而不是DNA。首先是提取某种生物或组织的总RNA或mRNA，然后用含有变性剂的琼脂糖凝胶电泳分离RNA，变性剂的作用是防止RNA自我退火形成局部双链，影响泳动率，干扰实验结果。电泳分离后再将凝胶上的RNA带吸印到尼龙膜上，在液相中和标记的核酸探针进行杂交。用此方法可以测定某基因表达的时空特异性。
五. Western blotting杂交　既然有了“南方”杂交，“北方”杂交，那么随之而来的就是“西方”杂交（Western blotting），但Western blotting和前面的几种杂交都不相同，它是用来测蛋白而不是检测核酸。此法是由电场的作用将电泳胶上的蛋白质带转移到尼龙膜上，以亲和反应或免疫反应或结合反应测定蛋白质技术。

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