分光光度计用于蛋白质的定量

　　光度计'>分光光度计用于蛋白质的定量分光光度计计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。

　　蛋白质的直接定量

　　这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质，一般要消除320nm 的“背景”信息，设定此功能“开”。与测试核酸类似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，*佳的线性范围在1.0-1.5 之间。实验中选择Warburg 公式显示样品浓度时，发现读数“漂移”。这是一个正常的现象。事实上，只要观察A280的吸光值的变化范围不超过1%，表明结果非常稳定。漂移的原因是因为Warburg 公式吸光值换算成浓度，乘以一定的系数，只要吸光值有少许改变，浓度就会被放大，从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单;但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰;另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。

　　比色法蛋白质定量

　　蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸(如酪氨酸，丝氨酸)与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。

　　比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。

　　Lowry 法：以*早期的Biuret 反应为基础，并有所改进。蛋白质与Cu2 反应，产生蓝色的反应物。但是与Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂;反应需要的时间较长;容易受到非蛋白物质的影响;含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物质的蛋白不适合此种方法。

　　BCA法：这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2 反应产生Cu ，后者与BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极强，反应后形成的化合物非常稳定。相对于Lowry法，操作简单，敏感度高。但是与Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。

　　Bradford 法：这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰595nm。其*大的特点是，敏感度好，是Lowry 和BCA 两种测试方法的2 倍;操作更简单，速度更快;只需要一种反应试剂;化合物可以稳定1小时，方便结果;而且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂相容。但是对于去污剂依然是敏感的。*主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。